Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
Development of recombinase polymerase amplification for naked eye detection of Mycobacterium avium Complex
Year (A.D.)
2019
Document Type
Thesis
First Advisor
ปาหนัน รัฐวงศ์จิรกุล
Faculty/College
Faculty of Allied Health Sciences (คณะสหเวชศาสตร์)
Department (if any)
Department of Transfusion Medicine and Clinical Microbiology (ภาควิชาเวชศาสตร์การธนาคารเลือดและจุลชีววิทยาคลินิก)
Degree Name
วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต
Degree Level
ปริญญาโท
Degree Discipline
วิทยาศาสตร์ระดับโมเลกุลทางจุลชีววิทยาทางการแพทย์และวิทยาภูมิคุ้มกัน
DOI
10.58837/CHULA.THE.2019.1151
Abstract
โรคติดเชื้อที่มีสาเหตุมาจาก Mycobacterium avium complex (MAC) มีอุบัติการณ์เพิ่มสูงขึ้นทั่วโลกรวมทั้งในประเทศไทย เนื่องมาจากการเพิ่มขึ้นของจำนวนผู้ป่วยที่มีภาวะภูมิคุ้มกันของร่ายกายต่ำ การวินิจฉัยเชื้อ MAC ในปัจจุบันที่อาศัยการเพาะเลี้ยงเชื้อและทดสอบปฏิกิริยาชีวเคมี นอกจากใช้ระยะเวลานานแล้ว ยังไม่สามารถจำแนกเชื้อได้ถึงระดับสปีชี่ส์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเชื้อ Mycobacterium avium และเชื้อ Mycobacterium intracellulare ซึ่งเป็นเชื้อ MAC ที่สำคัญและเพาะแยกได้บ่อยจากสิ่งส่งตรวจ ดังนั้นวัตถุประสงค์ของการศึกษาในครั้งนี้ คือการพัฒนาเทคนิค Recombinase Polymerase Amplification ร่วมกับการอ่านผลด้วยสี SYBR Green I (RPA/SYBR) ในการตรวจวินิจฉัยเชื้อ MAC ซึ่งอาศัยการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมภายใต้อุณหภูมิคงที่ ร่วมกับไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อเชื้อกลุ่ม MAC เชื้อ M. avium และเชื้อ M. intracellulare และอ่านผลที่เกิดขึ้นด้วยตาเปล่าได้ในทันทีภายหลังการเติมสี SYBR Green I ผลจากการทดสอบกับตัวอย่าง DNA ของเชื้อ MAC จำนวน 120 ตัวอย่าง พบว่าเทคนิค RPA/SYBR สามารถตรวจวินิจฉัยจำแนกสปีชี่ส์ของเชื้อ M. avium และเชื้อ M. intracellulare ได้อย่างมีประสิทธิภาพ โดยมีความไว 100% และความจำเพาะตั้งแต่ 80.7% ขึ้นไป ซึ่งจัดว่ามีความสอดคล้องในเกณฑ์ดีมากเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีหาลำดับเบส (สถิติ Kappa มีค่าตั้งแต่ 0.801 ขึ้นไป) ในขณะที่เมื่อเปรียบเทียบกับเทคนิค PCR มีความไวตั้งแต่ 89.2% ขึ้นไปและความจำเพาะตั้งแต่ 97.5% ขึ้นไป และมีความสอดคล้องในเกณฑ์ดีมากเช่นเดียวกัน (สถิติ Kappa มีค่าตั้งแต่ 0.863 ขึ้นไป) นอกจากนี้เทคนิค RPA/SYBR ยังมีค่าความเข้มข้นของ DNA ต้นแบบน้อยที่สุดที่สามารถตรวจได้ เท่ากับ 1 ng/µl และไม่เกิดปฏิกิริยาข้ามกลุ่มกับเชื้อส่วนใหญ่ของ Mycobacterium แม้ว่าเทคนิค RPA/SYBR ที่ได้พัฒนาขึ้น มีขั้นตอนการทดสอบที่ทำง่าย ไม่ซับซ้อน ให้ผลการทดสอบที่รวดเร็ว และสามารถอ่านผลได้ด้วยตาเปล่า และไม่จำเป็นต้องอาศัยเครื่องมือที่จำเพาะ ซึ่งเหมาะสำหรับนำมาใช้ตรวจคัดกรองเบื้องต้นในการวินิจฉัยเชื้อ MAC ในห้องปฏิบัติการในโรงพยาบาลขนาดเล็ก หรือห้องปฏิบัติการภาคสนาม อย่างไรก็ตาม ควรมีการศึกษาพัฒนาความจำเพาะเพิ่มเติม เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของเทคนิคดังกล่าวในอนาคต
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
Infections caused by Mycobacterium avium complex (MAC) has been increased globally, including Thailand, owing to the rising in immunocompromised patients. A current diagnosis, based on culture and biochemical tests, is time-consuming. Furthermore, it is not enabled to differentiate MAC in a species level, particularly between the most common isolated MAC, Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare. Thus, this study aimed to develop Recombinase Polymerase Amplification combined with a SYBR Green I, called RPA/SYBR, for diagnosis of MAC. The RPA/SYBR was depended on isothermal amplification directed by specific primers to MAC, M. avium and M. intracellulare, and was immediately read out by a naked eye after addition of a SYBR Green I. After examined with 120 DNA samples of MAC, RPA/SYBR was capable of differentiating between M. avium and M. intracellulare effectively. RPA/SYBR shown 100% and over 80.7% of sensitivity and specificity, respectively, and an excellent correlation (Kappa ≥ 0.801) when compared with nucleotide sequencing. While analyzing with PCR, RPA/SYBR shown over 89.2% and over 97.5% of sensitivity and specificity, respectively, and an excellent correlation (Kappa ≥ 0.863). Besides, a limit of detection of RPA/SYBR was 1 ng/µl, and there were no cross-reactions with most of the Mycobacterium species. Although, the developed RPA/SYBR was simple, rapid, easy for read out by a naked eye without the specific instruments, which is proper for a screening diagnosis of MAC in small healthcare settings or field laboratories. However, further development to improve a specificity should be concerned, in order to raise the efficiency of RPA/SYBR in future.
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
สุธาตุ, เทิดศักดิ์, "การพัฒนาเทคนิค RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION เพื่อตรวจหาเชื้อ Mycobacterium avium COMPLEX ด้วยตาเปล่า" (2019). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 9527.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/9527