Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
Development of recombinase polymerase amplification and helicase dependent isothermal amplification for genotypic detection of extended-spectrum β-lactamase - producing Escherichia coli in national cancer institute, Thailand
Year (A.D.)
2019
Document Type
Thesis
First Advisor
นันทรี ชัยชนะวงศาโรจน์
Faculty/College
Faculty of Allied Health Sciences (คณะสหเวชศาสตร์)
Department (if any)
Department of Transfusion Medicine and Clinical Microbiology (ภาควิชาเวชศาสตร์การธนาคารเลือดและจุลชีววิทยาคลินิก)
Degree Name
วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต
Degree Level
ปริญญาโท
Degree Discipline
วิทยาศาสตร์ระดับโมเลกุลทางจุลชีววิทยาทางการแพทย์และวิทยาภูมิคุ้มกัน
DOI
10.58837/CHULA.THE.2019.1152
Abstract
เชื้อ Escherichia coli ที่สร้างเอนไซม์ Extended-spectrum β-lactamase (ESBLs) เป็นปัญหาสำคัญที่พบในโรงพยาบาลทั่วโลก การตรวจจีโนไทป์ของเอนไซม์ ESBLs เป็นวิธีที่สำคัญและมีประโยชน์ในการควบคุมการแพร่กระจายของเชื้อดื้อยาและการเลือกใช้ยาต้านจุลชีพอย่างเหมาะสม การศึกษานี้มุ่งหวังจะพัฒนาเทคนิค Multiplex Recombinase polymerase amplification (Multiplex RPA) และ Helicase dependent amplification (HDA) สำหรับตรวจหายีนดื้อยา blaCTX-M, blaOXA, blaSHV และ blaTEM ในเชื้อ E. coli ในสถาบันมะเร็งแห่งชาติ ประเทศไทย เชื้อ E. coli จำนวน 144 ตัวอย่างที่แยกได้จากสิ่งส่งตรวจภายในงานจุลชีววิทยา สถาบันมะเร็งแห่งชาติ ช่วงระหว่างเดือนกุมภาพันธ์ 2017 ถึงเดือนกันยายน 2018 ถูกนำมาทดสอบความไวต่อยาต้านจุลชีพและตรวจคัดกรองการสร้างเอนไซม์ ESBLs ด้วยวิธี Disk diffusion ตามวิธีมาตรฐานของ CLSI ปี ค.ศ. 2017 เชื้อที่สร้างเอนไซม์ ESBLs จำนวน 95 ตัวอย่าง พบดื้อยาสูงสุดในยา Ampicillin (100%), Cefotaxime (100%), Cefdinir (100%) และ Ceftriaxone (99.9%) และเชื้อ E. coli จำนวน 144 ตัวอย่าง มียีน blaCTX-M (100%) รองลงมาคือ blaTEM (42.1%), blaOXA (30.5%) และ blaSHV (2.1%) ตามลำดับ โดยเป็นยีน ESBLs ชนิด CTX-M-15 สูงสุด (51.1%) รองลงมาคือ CTX-M-55 (18.1%), CTX-M-27 (17.0%), CTX-M-14 (14.9%) และชนิดอื่น ๆ คือ TEM-127 (1.1%), TEM-215 (1.1%), OXA-16 (2.1%) และ SHV-18 (2.1%) เชื้อที่พบยีน blaCTX-M-15 มีความสัมพันธ์กับการดื้อยา Gentamicin, Levofloxacin และ Amoxicillin/ Clavulanic acid เพิ่มมากขึ้น และเชื้อที่พบยีน blaCTX-M-55 มีความสัมพันธ์กับการดื้อยา Ceftazidime และ Gentamicin เพิ่มมากขึ้น เทคนิค Multiplex RPA สามารถเพิ่มปริมาณยีน blaCTX-M, blaOXA และ blaSHV ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 25 นาที และเทคนิค HDA สามารถเพิ่มปริมาณยีน blaTEM ได้ที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที ขีดจำกัดต่ำสุดในการตรวจหายีน blaCTX-M, blaOXA, และ blaSHV ด้วยเทคนิค Multiplex RPA เท่ากับ 5, 0.5 และ 0.5 นาโนกรัม ตามลำดับ และเทคนิค HDA สำหรับการตรวจหายีน blaTEM เท่ากับ 50 นาโนกรัม เมื่อเปรียบเทียบกับเทคนิค PCR พบว่าเทคนิค Multiplex RPA ที่พัฒนาขึ้นมีค่าความไวและความจำเพาะเท่ากับ 100% เทคนิค Multiplex RPA เป็นเทคนิคการตรวจที่รวดเร็ว มีค่าความไวและความจำเพาะสูง เหมาะกับการตรวจหายีนสร้างเอนไซม์ ESBLs ในห้องปฏิบัติการที่มีเครื่องมือจำกัด
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
Escherichia coli producing extended-spectrum β-lactamase (ESBLs) is a major problem in hospitals around the world. ESBLs genotyping is important and useful for surveillance, control of antimicrobial resistant spreading and rapid selection of appropriate treatments. This study aimed to develop multiplex RPA and HDA techniques for blaCTX-M, blaOXA, blaSHV and blaTEM detections in E. coli. Antibiotic susceptibility and ESBL confirmatory testing were determined by disk diffusion method according to the CLSI guidelines with 144 E. coli samples collected from various specimens in the Department of Microbiology, National Cancer Institute of Thailand during February 2017 to September 2018. The high frequency of drug resistance in 95 ESBLs isolates were Ampicillin (100%), Cefotaxime (100%), Cefdinir (100%) and Ceftriaxone (99.9%). All 95 ESBLs producing E. coli had blaCTX-M (100%) followed by 42.1% of blaTEM, 30.5% of blaOXA and 2.1% of blaSHV, respectively. The frequency of CTX-M-15 was predominate (51.1%) followed by CTX-M-55 (18.1%), CTX-M-27 (17.0%), CTX-M-14 (14.9%). Other subtypes were TEM-127 (1.1%), TEM-215 (1.1%), OXA-16 (2.1%), and SHV-18 (2.1%). E. coli harbouring blaCTX-M-15 significantly resist with Gentamicin, Levofloxacin and Amoxicillin/Clavulanic acid. E. coli harbouring blaCTX-M-55 significantly resist with Ceftazidime Gentamicin. The multiplex RPA was successfully amplified blaCTX-M, blaOXA, and blaSHV genes at 37 ºC within 25 min. The blaTEM gene was detected by HDA at 65 ºC for 30 min. The limit of detection for blaCTX-M, blaOXA, and blaSHV genes were 5, 0.5 and 0.5 ng, respectively, and at 50 ng for blaTEM gene. In comparison to PCR, multiplex RPA had both sensitivity and specificity of 100%. The developed multiplex RPA is promising tools for rapid, sensitive and specific identification of ESBLs genes in laboratory with limited resources.
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
อัศวคงคารัตน์, ธัชภร, "การพัฒนาเทคนิค RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION และ HELICASE DEPENDENT ISOTHERMAL AMPLIFICATION สำหรับตรวจจีโนไทป์ของเอนไซม์ EXTENDED-SPECTRUM β-LACTAMASE ที่สร้างจากเชื้อ Escherichia coli ในสถาบันมะเร็งแห่งชาติ ประเทศไทย" (2019). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 9528.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/9528