Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

L-phenylalanine production by recombinant Escherichia coli under regulation of T7 and ara promoters

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

การผลิตแอลฟีนิลอะลานีนโดย Escherichia coli รีคอมบิแนนท์ภายใต้การควบคุมการแสดงออกของโปรโมเตอร์ T7 และ ara

Year (A.D.)

2014

Document Type

Thesis

First Advisor

Kanoktip Packdibamrung

Faculty/College

Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)

Degree Name

Master of Science

Degree Level

Master's Degree

Degree Discipline

Biochemistry

DOI

10.58837/CHULA.THE.2014.917

Abstract

L-Phenylalanine (L-Phe) is mainly used as a reactant for production of important substances in medical and food industry such as aspartame. An increase in demand for aspartame leads to the improvement of L-Phe production in microorganisms, especially Escherichia coli by metabolic engineering. In this research, L-Phe production was increased by cloning four important genes in L-Phe biosynthesis pathway (aroB, aroL, phedh and tktA) into pRSFDuet-1 vector. After that the recombinant plasmid was co-transformed with pBAD33 vector containing a glycerol uptake gene (glpF) and an aromatic amino acid exporter gene (yddG) into E. coli BL21(DE3). Response surface methodology (RSM) was applied to optimize concentration of glycerol and ammonium sulfate. The highest production of L-Phe at 746 mg/L was obtained when the recombinant clone was cultured in minimum medium containing (g/L): glycerol 31; (NH₄) ₂SO₄ 63; MgSO₄·7H₂O 0.3; CaCl₂·2H₂O 0.015; KH₂PO₄4 3.0; K₂HPO₄ 12; NaCl 1; FeSO₄·7H₂O/Na-citrate 0.075 /1.0; thiamine·HCl 0.0075 and trace element solution (containing (g/L): Al₂ (SO₄)3·18H₂O 2.0; CoSO4·7H₂O 0.75; CuSO₄·5 H₂O 2.5; H3BO3 0.5; MnSO₄·H₂O 24; Na₂MoO₄·2H₂O 3.0; NiSO₄·6H₂O 2.5 and ZnSO₄·7 H₂O 15) 1.5 ml/L pH 7.0 at 37 °C after induction by 0.02% arabinose for 240 hours.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

แอล-ฟีนิลอะลานีน (L-Phe) เป็นสารตั้งต้นในการผลิตสารสำคัญในทางการแพทย์และอุตสาหกรรมอาหาร เช่น แอสปาร์แตม จากความต้องการในการใช้แอสปาร์แตมที่เพิ่มมากขึ้นนำไปสู่การปรับปรุงผลิต L-Phe ในจุลินทรีย์โดยเฉพาะใน Escherichia coli โดยกระบวนการวิศวกรรมเมแทบอลิซึม งานวิจัยนี้ได้ทำการเพิ่มการผลิตแอล-ฟีนิลอะลานีนโดยโคลนยีนที่สำคัญในวิถีการสังเคราะห์ L-Phe จำนวน 4 ยีน (aroB, aroL, phedh และ tktA) เข้าสู่เวคเตอร์ pRSFDuet-1 จากนั้นทรานส์ฟอร์มเข้าสู่ E. coli BL21(DE3) ร่วมกับยีนที่เข้ารหัสโปรตีนที่นำกลีเซอรอลเข้าสู่เซลล์ (glpF) และยีนที่เข้ารหัสโปรตีนที่นำกรดอะมิโนชนิดอะโรมาติกออกนอกเซลล์ (yddG) ที่อยู่ในเวคเตอร์ pBAD33 การหาความเข้มข้นที่เหมาะสมของกลีเซอรอล แอมโมเนียมซัลเฟต โดยใช้ response surface methodology (RSM) พบว่า โคลนดังกล่าวสามารถผลิต L-Phe ได้สูงสุด คือ 746 มิลลิกรัมต่อลิตร เมื่อเลี้ยงในสูตรอาหารที่มีส่วนประกอบดังนี้ (กรัมต่อลิตร): กลีเซอรอล 31; แอมโมเนียมซัลเฟต 63; MgSO₄·7H₂O 0.3; CaCl₂·2H₂O 0.015; KH₂PO₄ 3.0; K₂HPO₄ 12; NaCl 1; FeSO₄·7H₂O/Na-citrate 0.075/1.0; thiamine·HCl 0.0075 และสารละลาย trace element (ประกอบด้วย (กรัมต่อลิตร): Al₂ (SO₄)3·18H₂O 2.0; CoSO₄·7H₂O 0.75; CuSO₄·5 H₂O 2.5; H₃BO₃ 0.5; MnSO₄·H₂O 24; Na₂MoO₄·2H₂O 3.0; NiSO₄·6H₂O 2.5 and ZnSO₄·7H₂O 15) 1.5 มิลลิลิตรต่อลิตร pH 7.0 ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส หลังการเหนี่ยวนำโดยอะราบิโนส 0.02 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 240 ชั่วโมง

Link to Full Text

Share

COinS