Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

การเพิ่มเซลลูเลสแอกทิวิตีของ Trichoderma reesei TISTR 3081 โดยการกลายพันธุ์ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วยเอทิลมีเทนซัลโฟเนต รังสีอัลตราไวโอเลตและโคลชิซีน

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

Cellulase activity enhancement of TISTR 3081 By induced mutation with ethylmethanesulfonnate ultraviolet radiation and colchicine

Year (A.D.)

2008

Document Type

Thesis

First Advisor

วรวุฒิ จุฬาลักษณานุกูล

Faculty/College

Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)

Degree Name

วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Degree Level

ปริญญาโท

Degree Discipline

เทคโนโลยีชีวภาพ

DOI

10.58837/CHULA.THE.2008.921

Abstract

ลิกโนเซลลูโลซิก เอทานอลเป็นพลังงานหมุนเวียนทางเลือกหนึ่งที่กำลังได้รับความสนใจโดยอาศัยเซลลูเลสในการย่อยสลาย แต่ในขณะเดียวกันเอนไซม์ก็ยังคงมีราคาที่สูงอีกทั้งเชื้อ Trichoderma reesei ยังมีแอกทิวิตีไม่สูงมาก ในงานวิจัยนี้นำเชื้อ Trichoderma reesei TISTR 3081 มาชักนำให้เกิดการกลายพันธุ์ด้วยสารอีเอ็มเอส รังสีอัลตราไวโอเลต และสารโคลชิซีน เพื่อเพิ่มแอกทิวิตีจำเพาะของเซลลูเลส หลังจากทำการกลายพันธุ์ด้วยสารอีเอ็มเอสและกลายพันธุ์ซ้ำด้วยรังสีอัลตราไวโอเลต พบว่าไอโซเลต E45-UV26 มีแอกทิวิตีจำเพาะของเอนโดกลูคาเนส เอกโซกลูคาเนส และเบตา-กลูโคซิเดส สูงกว่าสายพันธุ์ตั้งต้น 1.41, 1.69 และ 2.53 เท่า ตามลำดับ โดยทดสอบความสามารถในการผลิตเซลลูเลสในอาหารเหลวสูตรของแมนเดล ที่มีแอลฟา-เซลลูโลสเป็นแหล่งคาร์บอน และจากการนำ E45-UV26 มาทดสอบลำดับเบสในนิวคลีโอไทด์ของ cbh1 และ cbh2 พบว่าลำดับเบสของ cbh1 มีการเปลี่ยนแปลงของลำดับเบส 4 ตำแหน่ง คือบริเวณอินทรอนตำแหน่งเบสที่ 710 และ 734 ในส่วนเอกซอนตำแหน่งเบสที่ 812 และ 924 การที่มีตำแหน่งเบสที่บริเวณเอกซอนทำให้มีการสังเคราะห์กรดอะมิโนเปลี่ยนแปลงหนึ่งตัว คือเปลี่ยนจาก Asparagine ไปเป็น Threonine และหลังจากการใช้ 0.1 เปอร์เซ็นต์ สารโคลชิซีนในเชื้อ E45-UV24, E45-UV26 และ E45-UV39 เป็นเวลา 20 วัน พบว่า EV39-C69 มีแอกทิวิตีจำเพาะในหน่วยยูนิตต่อมิลลิกรัมโปรตีนของเอนโดกลูคาเนส เอกโซกลูคาเนส สูงกว่าสายพันธุ์ตั้งต้น 2.16 และ 1.35 เท่า ตามลำดับ แต่เนื่องจากเชื้อที่ผ่านการใช้โคลชิซีนส่วนใหญ่จะมีการผลิตโปรตีนที่เพิ่มสูงขึ้น ถ้าคำนวณเป็นค่าแอกทิวิตีในหน่วยยูนิตต่อมิลลิลิตร พบว่า EV24-C46 มีแอกทิวิตีของเอนโดกลูคาเนส เอกโซกลูคาเนส และ เบตา-กลูโคซิเดส สูงกว่าสายพันธุ์ตั้งต้น 2.09, 2.20 และ 1.21 เท่า ตามลำดับ จากการศึกษาครั้งนี้พบว่าการกลายพันธุ์ด้วยสารอีเอ็มเอส ร่วมกับการใช้รังสีอัลตราไวโอเลตสามารถใช้ในการเพิ่มการผลิตเซลลูเลสได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าการใช้สารอีเอ็มเอสเพียงอย่างเดียวในเชื้อ T. reesei TISTR 3081

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

Lignocellulosic ethanol is one of the most promising renewable energy, but the high cost of enzyme is one of the major barriers. The enzyme cellulase from wild type Trichoderma reesei must be improved to make bioetanol more economical due to its low activity and concentration. To resolve this issue this research project aims to improve the cellulose activity by induce mutation on Trichoderma reesei TISTR 3081 via ethylmethanesulfonate (EMS), ultraviolet radiation (UV) and colchicine. After induced for double mutation with EMS treatment and ultraviolet radiation mutation, it was found that isolate E45-UV26 had higher specific activities of endoglucanase, exoglucanase, and β-glucosidase than those of wild type by 1.41, 1.69, and 2.53 times, respectively. Cellulase-producing ability was tested in Mandels' medium containing alpha-cellulose as the sole carbon source. Nucleotide base sequencing of cbh1 and cbh2 revealed that the base order of cbh1 had mutations in 4 positions, i.e. base orders 719 and 734 of the intron and base orders 812 and 924 of the exon. The base order of the exon caused a change in the synthesis of an amino acid, from Asparagine to Threonine. After treating isolates E45-UV24, E45-UV26, and E45-UV39 with colchicine for 20 days, it was found that isolate EV39-C69 had higher specific activities than those of wild type by milligram of protein of endoglucanase and exoglucanase by 2.16 and 1.35 times, respectively. However, as most isolates would have higher protein production after treatment with colchicine, if the activities were calculated as units per millilitre, EV24-C46 would be revealed that the activities of endoglucanase, exoglucanase, and β-glucosidase were 2.09, 2.20, and 1.21 times higher than those of the wild type, respectively. This study found that mutation with EMS together with ultraviolate radiation can increase the production of cellulase more effectively than using EMS alone in T. reesei TISTR 3081.

Link to Full Text

Share

COinS