Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

จลนพลศาสตร์ของการจับระหว่างอะโปเซอรูโลพลาสมินกับตะกั่วหรือทองแดง

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

Kinetics of lead or copper binding on apoceruloplasmin

Year (A.D.)

1999

Document Type

Thesis

First Advisor

สุกัญญา สุนทรส

Faculty/College

Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)

Degree Name

วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Degree Level

ปริญญาโท

Degree Discipline

ชีวเคมี

DOI

10.58837/CHULA.THE.1999.608

Abstract

ในการศึกษาจลนพลศาสตร์ของการจับระหว่างอะโอเซอรูโลพลาสมินของคนกับโลหะ จำเป็นต้องใช้อะโปเซอร์โลพลาสมิน จึงทดสอบความสามารถของสารขับโลหะ 4 ชนิด ได้แก่ penicillamine, DMPS, DTC และ EDTA ในการดึงทองแดงออกจากโมเลกุลของโฮโลเซอรูโลพลาสมิน พบว่าสารจับโลหะ 3 ชนิดแรกสามารถดึงทองแดงที่มีส่วนเกี่ยวข้องกับออกซิเดส แอคติวิตีได้อย่างสมบูรณ์ที่ความเข้มข้น 1.0, 1.0 และ 3.5 มก./มล. ตามลำดับ ส่วน EDTA ที่ 3.5 มก./มล. สามารถลดแอคติวิตีลงได้เพียง 80% เมื่อเปรียบเทียบดูการเคลื่อนที่ในสนามไฟฟ้าระหว่างโฮโลเซอรูโลพลาสมินกับเซอรูโลพลาสมินทำปฏิกิริยากับสารจับโลหะทั้ง 4 ชนิด ในอิเล็กโทรโฟริซีสแบบไม่เสียสภาพที่ pH 8.8 และไอโซอิเลคทริกโฟกัสซิง พอลิอะคริลาไมด์เจลในช่วง pH 4-6 ไม่พบความแตกต่างของทุกตัวในระบบเจลทั้ง 2 ชนิด แต่ในยูเรียพอลิอะคริลาไมด์เจลที่ pH 8.4 พบว่าโฮโลเซอรูโลพลาสมินที่ทำปฏิกิริยากับสารจับโลหะ DTC เคลื่อนที่ช้ากว่าโฮโลเซอรูโลพลาสมินอยู่เล็กน้อยในยูเรียพอลิอะคริลาไมด์เจลที่ pH 8.4 ทำให้สันนิษฐานได้ว่าบริเวณที่จับกับทองแดงอยู่ภายในโมเลกุลของโปรตีน หลังจากทำปฏิกิริยากับ DMPS และ DTC พบว่าเซอรูโลพลาสมินยังมีทองแดงเหลืออยู่ในโมเลกุล 30% และ 25% ตามลำดับ จึงเตรียมอะโปเซอรูโลพลาสมินที่มีปริมาณทองแดงน้อยลงโดยไดแอไลซ์กับสารกับโลหะ DTC 5 mg/ml ร่วมกับ ascorbic acid 10 mM ที่ 4 ํ ซ, 5 ซม. อะโปเซอรูโลพลาสมินที่ได้มีปริมาณทองแดงเพียง 2% นำอะโปเซอรูโลพลาสมินไปศึกษาทางจลนพลศาสตร์ของการจับกับโลหะ จากการวิเคราะห์โดยกราฟแบบ metal-saturation curve และ double reciprocal plot พบว่าทองแดงเข้าจับกับอะโปเซอรูโลพลาสมินแบบ non-cooperativity ซึ่งมีค่าคงที่ของการแตกตัว (Kd) เท่ากับ 3.20 muM จำนวนทองแดงที่จับกับอะโปเซอรูโลพลาสมินสูงสุด (n) เท่ากับ 7.25 อะตอมต่อโมเลกุล ผลจาก Scatchard plot แสดงว่าตำแหน่งที่จับกับทองแดงอาจมีมากกว่า 1 ชนิด ส่วนการจับระหว่างอะโปเซอรูโลพลาสมินกับตะกั่วแตกต่างกับทองแดงคือ metal-saturation curve ชี้ให้เห็นว่าเป็นแบบ positive allostericity และ Hill plot ให้ค่า nH (maximum Hill slope) เท่ากับ 3.42 สำหรับการจับอย่างแน่น Kd เท่ากับ 1.10 muM และจำนวนตะกั่วที่เข้าจับเท่ากับ 2.54 อะตอมต่อโมเลกุล สำหรับการจับอย่างหลวมค่า Kd เท่ากับ 2.67 muM และจำนวนตะกั่วที่เข้าจับเท่ากับ 2.84 อะตอมต่อโมเลกุล ได้ศึกษาการจับระหว่างตะกั่วกับโฮโลเซอรูโลพลาสมินด้วย เพื่อยืนยันว่าตะกั่วสามารถแทนที่ทองแดงในโฮโลเซอรูโลพลาสมินพบว่ารูปแบบการจับเป็นแบบ positive allostericity เช่นกัน มีค่า nH (maximum Hill slope) เท่ากับ 1.72 สำหรับการจับอย่างแน่น Kd เท่ากับ 0.54 muM และจำนวนตะกั่วที่เข้าจับ เท่ากับ 1.49 สำหรับการจับอย่างหลวมค่า Kd เท่ากับ 2.80 muM และจำนวนตะกั่วที่เข้าจับเท่ากับ 1.79 ผลที่ได้เสนอว่า allosterism อาจเป็นปัจจัยสำคัญที่ทำให้เกิดการแทนที่

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

In an attempt to study metal-binding kinetics of human ceruloplasmin, apocerulplasmin (aCP) was required. Four metal chelators, namely, penicillamine, DMPS, DTC and EDTA were screened for their ability in chelating Cu from the holoceruloplasmin (hCP). The three former chelators, concentration of 1.0, 1.0 and 3.5 mg/ml could completely remove Cu-required oxidase activity from the hCP, respectively. 3.5 mg/ml EDTA could only 80% inhibit the enzyme. Electrophoresis in non-denaturing polyacrylamide gel at pH 8.8 or isoelectric focusing (pH 4-6) polyacrylamide gel could not be used to confirm the chelation. Different migration of hCP and metal-chelated CP in urea gel at pH 8.4 was obtained. This suggested that the binding sites for oxidase required Cu were deeply located in the protein molecule. After the chelation with DMPS and DTC, the CP still retained Cu content of 30% and 25%, respectively. Extensive removal of Cu was done by dialyzing the CP with 5 mg/ml DTC in the presence of 10 mM ascorbic acid at 4 ํC for 5 hr, aCP with 2% Cu retained was obtained. The obtained aCP was used to study metal-binding kinetics. The binding of Cu to aCP, analyzed with metal-saturation curve and double reciprocal plot showed non-cooperativity with Kd of 3.20 muM and the number of Cu binding (n) of 7.25 atoms/molecule. Results from Scatchard plot suggested the heterogeneity of Cu binding. Pb binding differed from the former by its nature, i.e. the positive allostericity was obtained on Pb-saturation curve. Analyzed with Hill plot showed the nH (maximum Hill plot) of 3.42, Kd of 1.10 muM and n of 2.54 atoms/molecule for strong binding, Kd of 2.67 muM and n of 2.84 atoms/molecule for weak binding. Pb binding was also performed on the hCP to confirm that the metal could replace the native Cu on the molecule. Allostericity was again obtained with nH of 1.72, Kd of 0.54 muM and n of 1.49 atoms/molecule for strong binding, Kd of 2.80 muM and n of 1.79 atoms/molecule for weak binding. The result suggested that allosterism may serve as a main factor for the replacement.

Link to Full Text

Share

COinS