Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
การพัฒนาเทคนิคระดับโมเลกุลเพื่อประเมินและจัดการความเสี่ยงของ Listeria monocytogenes และ L. innocua ในโรงงานผลิตไก่ปรุงสุกแช่เยือกแข็ง
Year (A.D.)
2017
Document Type
Thesis
First Advisor
Suwimon Keeratipibul
Faculty/College
Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)
Degree Name
Doctor of Philosophy
Degree Level
Doctoral Degree
Degree Discipline
Biotechnology
DOI
10.58837/CHULA.THE.2017.36
Abstract
Thailand is one of the largest cooked chicken meat exporting country in the world. Unfortunately, these products can be contaminated with L. monocytogenes causes the disease Listeriosis which carries a fatality rate of 30 to 40 percent. Therefore, the various importing countries including Japan and the European countries require a zero tolerance for L. monocytogenes in the cooked chicken products. Besides, all Listeria spp. occurrence, and not only L. monocytogenes, in these products is also unacceptable to the importers. Rejection of Listeria contaminated product can reach over 5 to 20 million baht per factory per year. Hence, the aim of this study was to introduce a cost-effective molecular approach to detect, identify, and subtype L. monocytogenes and L. innocua for tracking sources of contamination. Firstly, a new comprehensive BE-LisAll biomarker for Listeria detection using in silico scheme was developed. The results showed that biomarker has a 100% specificity for Listeria species detection and could differentiate Listeria species from a variety of non-Listeria bacteria. Secondly, HRMA of rarA and ldh method which identified 9 species belonging to the genus Listeria was established. The method can be considered sufficiently applicable as method for identifying the species of Listeria isolates from the food factory with a success rate of 92.6%. Thirdly, a recently validated PCR primer set targeting the VNTR of L. monocytogenes of Chenal-Francisque et al. and a novel PCR primer set targeting the VNTR designed based on completed genome sequence of L. innocua CLIP 11262 were validated and verified. The CE-based MLVA protocols provided higher discriminatory power for subtyping of L. monocytogenes and L. innocua than RAPD method. Fourthly, a cost-effective NGS-based MLVA by PGM using 9 adopted (JLR1, JLR2, JLR4, LisTR1317, LisTR881, LMTR4, LMV1, LMV6, and LMV9) and 6 novel (TR1, TR3, TR5, TR6, TR10, and TR13) VTNR loci was developed. This method provided higher discriminatory power for differentiating between L. monocytogenes and L. innocua strains than CE-based MLVA. Finally, the developed MLVA was applied to investigate sources and routes of Listeria contamination for reducing the risk of L. monocytogenes and L. innocua contamination in cooked frozen chicken meat process. The relationships of the L. monocytogenes and L. innocua in the final products and those in the environment were evaluated. The results showed that L. monocytogenes and L. innocua in finished products can be contaminated from various sources such as dicer, floor, and cart wheel. After revised the suitable procedures, the prevalence of Listeria spp. in the finished product and processing environment were decreased, significantly. These demonstrated that the developed techniques and approaches have the potential to provide an efficient tool for investigating and tracking the routes and sources of contamination of L. monocytogenes and L. innocua in frozen cooked chicken plant.
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
ประเทศไทยเป็นประเทศที่ส่งออกเนื้อไก่ปรุงสุกเป็นอันดับต้นๆของโลก อย่างไรก็ตามผลิตภัณฑ์เหล่านี้สามารถตรวจพบการปนเปื้อนของ L. monocytogenes ซึ่งเป็นสาเหตุของโรค Listeriosis อัตราการเสียชีวิตจากโรคนี้มีมากถึง 30-40 เปอร์เซ็นต์ ดังนั้นในหลายประเทศรวมถึงญี่ปุ่นและกลุ่มประเทศสหภาพยุโรปจึงต้องการผลิตภัณฑ์ที่ปลอด L. monocytogenes โดยผู้นำเข้าได้กำหนดมาตรการที่เข้มงวดยิ่งขึ้น คือ ไม่ให้พบทุกสปีชีส์ของ Listeria เลย ในปีหนึ่งๆ พบว่ามีสินค้าที่ถูกปฎิเสธการนำเข้าเนื่องจากปนเปื้อน Listeria spp. เป็นมูลค่า 5-20 ล้านบาทต่อโรงงานผู้ส่งออก ดังนั้นการศึกษานี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อเสนอเทคนิคระดับโมเลกุลที่ประหยัดต้นทุนสำหรับตรวจหา จำแนก และระบุสายพันธุ์ ของ L. monocytogenes และ L. innocua เพื่อการตรวจติดตามแหล่งการปนเปื้อน ขั้นแรก ได้พัฒนาเครื่องหมายโมเลกุล BE-LisAll เพื่อตรวจหา Listeria โดยใช้โปรแกรม in silico พบว่ามีความจำเพาะต่อสปีชีส์ของ Listeria 100 เปอร์เซ็นต์ และสามารถแยก Listeria ออกจากแบคทีเรียชนิดอื่นได้ ขั้นที่สอง ได้พัฒนาเทคนิค high resolution melting analysis โดยใช้ rarA และ ldh เพื่อจำแนก Listeria จำนวน 9 สปีชีส์ พบว่ามีความสามารถเพียงพอที่จะจำแนกสปีชีส์ของ Listeria ที่แยกได้จากโรงงาน โดยมีอัตราความสำเร็จ 92.6 เปอร์เซ็นต์ ขั้นที่สาม ได้พัฒนาเทคนิค capillary electrophoresis-based MLVA โดยใช้ชุดไพรเมอร์ VNTR ของ L. monocytogenes ของ Chenal-Francisque และคณะ และชุดไพรเมอร์ VNTR ของ L. innocua จากการออกแบบใหม่โดยอาศัยข้อมูลรหัสจีโนม L. innocua CLIP 11262 เพื่อจำแนกความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์ (subtyping) ของ L. monocytogenes และ L. innocua พบว่าเทคนิค CE-based MLVA มีศักยภาพในการจำแนกความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์ของ Listeria ทั้งสองสปีชีส์ได้สูงกว่าเทคนิค random amplified polymorphic DNA (RAPD) ขั้นที่สี่ ได้พัฒนาเทคนิค next generation sequencing-based MLVA ด้วยเครื่อง Ion Torren Personal Genome Machine (PGM) โดยใช้ไพรเมอร์ VNTR ของ L. monocytogenes ที่ได้รับการทวนสอบแล้ว จำนวน 9 คู่ (JLR1 JLR2 JLR4 LisTR1317 LisTR881 LMTR4, LMV1 LMV6 และ LMV9) และไพรเมอร์ VNTR ของ L. innocua ที่ถูกออกแบบใหม่ จำนวน 6 คู่ (TR1 TR3 TR5 TR6 TR10 และ TR13) เพื่อใช้ในการจำแนกความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์ของ L. monocytogenes และ L. innocua โดยพบว่าเทคนิค NGS-based MLVAมีศักยภาพในการจำแนกความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์ของ Listeria ทั้งสองสปีชีส์ได้สูงกว่าเทคนิค CE-based MLVA และขั้นสุดท้าย ได้นำเทคนิค MLVA ที่พัฒนาขึ้นไปสำรวจแหล่งและเส้นทางการปนเปื้อนของ L. monocytogenes และ L. innocua ในโรงงานผลิตไก่ปรุงสุกแช่เยือกแข็ง พบว่าจากการประเมินความสัมพันธ์ระหว่างรูปแบบลายพิมพ์ดีเอ็นเอของ L. monocytogenes และ L. innocua ที่ปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์กับสิ่งแวดล้อม แสดงให้เห็นว่า Listeria ทั้งสองสปีชีส์ที่พบในผลิตภัณฑ์มีโอกาสปนเปื้อนได้จากหลายแหล่ง เช่น เครื่องหั่น พื้น และล้อรถเข็น โรงงานจึงได้ปรับเปลี่ยนวิธีการล้างทำความสะอาดและฆ่าเชื้อให้เหมาะสมขึ้น พบว่าสามารถลดการปนเปื้อนของ Listeria ในผลิตภัณฑ์และสิ่งแวดล้อมได้อย่างมีนัยสำคัญ งานวิจัยนี้แสดงให้เห็นว่าเทคนิคที่ถูกพัฒนาขึ้นมีศักยภาพในการใช้เป็นเครื่องมือสำหรับตรวจสอบ ติดตามเส้นทางและหาแหล่งการปนเปื้อนของ L. monocytogenes และ L. innocua ในโรงงานผลิตไก่ปรุงสุกแช่เยือกแข็งได้อย่างมีประสิทธิภาพ
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
Phraephaisarn, Chirapiphat, "DEVELOPMENT OF MOLECULAR TECHNIQUE FOR RISK ASSESSMENT AND RISK MANAGEMENT OF Listeria monocytogenes AND L. innocua IN FROZEN COOKED CHICKEN PLANT" (2017). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 526.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/526