Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
3,4-ไดไฮดรอกซี-5,4'-ไดเมทอกซีไบเบนซิลทำให้เซลล์มะเร็งปอดชนิดไม่ใช่เซลล์เล็กไวต่อการตายแบบอะพอพโทซิสจากซิสพลาทินผ่านการปรับเพิ่ม พี 53
Year (A.D.)
2021
Document Type
Thesis
First Advisor
Pithi Chanvorachote
Faculty/College
Faculty of Pharmaceutical Sciences (คณะเภสัชศาสตร์)
Department (if any)
Department of Pharmacology and Physiology (fac. Pharmaceutical Science) (ภาควิชาเภสัชวิทยาและสรีรวิทยา (คณะเภสัชศาสตร์))
Degree Name
Doctor of Philosophy
Degree Level
Doctoral Degree
Degree Discipline
Pharmacology and Toxicology
DOI
10.58837/CHULA.THE.2021.314
Abstract
Lung cancer is a leading fatal malignancy with the highest number of cancer deaths. Targeting a specific protein regulating cancer progression and metastasis has been attracting much attention for the development of cancer therapy. Thus, this study was aimed to investigate the effect of 3,4-dihydroxy-5,4′-dimethoxybibenzyl (DS-1) in targeting MDM2-attenuating p53 function and inhibition EMT in lung cancer cells. The efficacy of DS-1 or combined with cisplatin in lung cancer cells was determined by MTT, nuclear staining, and Annexin V/PI assays. The expression of apoptosis- and EMT-related proteins was determined by western blot analysis. Metastatic behaviors were evaluated by cell shape characterization, migration, invasion, and anchorage-independent cell growth assay. To investigate the role of DS-1 on stabilization and degradation of p53, cycloheximide chasing assay and immunoprecipitation were conducted, and the active form of p53 was investigated by immunofluorescent staining assay. To confirm and demonstrate the site interaction between DS-1 and MDM2 protein, the in silico computational analysis was performed. The results showed that DS-1 exhibited a cytotoxic effect and sensitized lung cancer cells to cisplatin-induced apoptosis. DS-1 caused a significant increase in cellular level of p53 protein, while the active form of p53 (phosphorylation at Ser15) was insignificant change. DS-1 combined with cisplatin could enhance p-p53 (Ser15) and p53 downstream signaling (Bax, Bcl-2, and Akt), leading to higher level of apoptosis. Immunoprecipitation analysis revealed that DS-1 decreased p53-ubiquitin complex, a prerequisite step of p53 proteasomal degradation. Molecular docking simulation further evidenced that DS-1 interacts with MDM2 within p53-binding domain by carbon-hydrogen bond interaction at Lys27, π-Alkyl interactions at Ile37, and Leu30, and Van der Waals interactions at Ile75, Val51, Val69, Phe67, Met38, Tyr43, Gly34, Phe31, and Lys27. Treatment of DS-1 and cisplatin in patient-derived primary lung cancer cells showed the consistent effects of increasing cisplatin sensitivity. For cancer metastasis, DS-1 significantly inhibited the proliferation of lung cancer cells compared to the control group. The aggressive behavior of cancer cells including migration and invasion ability was significantly reduced in the DS-1-treated cells. Besides, anchorage-independent growth analysis provides evidence that DS-1 could suppress the growth of the cancer cell in detached condition indicated by the significant reduction in cell colony size and number. For mechanisms, we found that DS-1 suppressed EMT indicated by the reduction of EMT markers namely N-cadherin, Snail, and Slug, while increasing epithelial maker of E-cadherin. Also, DS-1 was shown to decrease the cellular levels of integrin β1. Our findings provide evidence of DS-1 as an MDM2 inhibitor and metastasis prevention through integrin and FAK suppression, which may benefit the development of this compound for lung cancer treatment.
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
มะเร็งปอดนั้นเป็นโรคร้ายแรงที่มีอันตรายต่อชีวิตลำดับต้นๆ ซึ่งมีตัวเลขการเสียชีวิตมากที่สุดในกลุ่มโรคมะเร็งทั้งหลาย การตั้งเป้าหมายค้นหาโปรตีนพิเศษที่สามารถควบคุมการเจริญเติบโตของมะเร็งและการแพร่กระจายของเนื้อร้ายนั้นถือว่าเป็นงานที่น่าสนใจเป็นอย่างมากในกระบวนการรักษาโรคมะเร็ง ด้วยเหตุนี้ งานวิจัยชิ้นนี้มีวัตถุประสงค์ในการตรวจสอบผลของสาร 3,4-ไดไฮดรอกซี-5 4’-ไดเมท็อกซีเบนซิล (DS-1) ในการมุ่งหวังให้เกิดกระบวนการลดทอนโปรตีน P53 ด้วยยีน MDM2 และการยับยั้งการเปลี่ยนสภาพเซลล์ (EMT) ในเซลล์มะเร็งปอด ประสิทธิผลของสาร DS-1 หรือสารที่ผสมกับยาต้านซิสพลาตินในเซลล์มะเร็งปอดนั้นได้รับการทดสอบโดยกระบวนการ MTT, การย้อมนิวเคลียส, และการทดสอบวิธี Annexin V/PI การแสดงผลของโปรตีนที่เกี่ยวเนื่องกับอะพอบโทซิสและการเปลี่ยนสภาพเซลล์นั้นได้รับการทดสอบโดยการวิเคราะห์ด้วยเทคนิคเวสเทิร์นบล็อต อาการแพร่กระจายของเนื้อร้ายนั้นได้รับการประเมินโดยการกำหนดลักษณะรูปร่างเซลล์ การแพร่กระจาย การรุกรานเซลล์อื่น และการทดสอบการเจริญเติบโตที่ไม่ต้องอาศัยเซลล์ยึดเกาะ (anchorage-independent cell growth) ในการตรวจสอบบทบาทของสาร DS-1 ต่อการสร้างภาวะเสถียรและลดโปรตีน P53 นั้น ผู้วิจัยได้ดำเนินการทดสอบไซโคลเฮกซิไมด์ และ การทดสอบการตกตะกอนโปรตีน (Immunoprecipitation) และโปรตีน P53 สภาพดีได้รับการทดสอบโดยวิธีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ เพื่อที่จะยืนยันและแสดงใหเห็นถึงปฏิสัมพันธ์ต่อกันระหว่างสาร DS-1 และโปรตีน MDM2 ผุ้วิจัยได้ดำเนินกระบวนการวิเคราะห์โดยคอมพิวเตอร์ (in silico) ผลลัพธ์ที่ได้แสดงให้เห็นว่า สาร DS-1 ให้สภาวะเป็นพิษต่อเซลล์ และทำให้เซลล์มะเร็งปอดรับเอากระบวนการอะพอบโทซิสของยาต้านมะเร็งซิสพลาติน สาร DS-1 ก่อให้เกิดการเพิ่มระดับของโปรตีน P53 ในระดับเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ โปรตีน P53 สภาพดีนั้นมีการเปลี่ยนแปลงในระดับเล็กน้อยมาก สาร DS-1 ที่รวมกับยาต้านมะเร็งซิสพลาตินอาจจะยกระดับโปรตีน p-p53 (Ser15) และการส่งสัญญาณผ่านเซลล์ของโปรตีน P53 (Bax, Bcl-2 และ Akt) ซึ่งจะนำไปสู่กระบวนการอะพอบโทซิสในระดับที่สูงกว่าได้ การวิเคราะห์การตกตะกอนโปรตีนเผยให้เห็นว่า สาร DS-1 ลดจำนวนโปรตีนเชิงซ้อน P53-ยูบิควิตินลง ซึ่งเป็นขั้นตอนที่เกิดก่อนการสลายโปรตีน P53 โปรแกรมการจำลองการจับกันยังพิสูจน์ได้ว่า สาร DS-1 มีปฏิสัมพันธ์ต่อโปรตีน MDM2 ภายใต้ขอบเขตพันธะของโปรตีน P53 โดยปฏิกิริยาพันธัเคมีระหว่างคาร์บอนกับไฮโดเจน ที่สาร Lys27 ปฏิกิริยา Pi-Alkyl ที่ lle37 และ Leu30 และปฏิกิริยาแวนเดอร์วาลล์ (Van der Waals) ที่ lle75, Val51, Val69, Phe67, Met38, Tyr43, Gly34, Phe31, และ Lys27 กระบวนการจัดการสาร DS-1 และยาซิสพลาตินในเซลล์มะเร็งปอดส่วนหลักที่ค่อยๆ แพร่สู่ร่างกายแสดงให้เห็นถึงผลลัพธ์ที่สอดคล้องกันของการกระตุ้นการรับยาต้านมะเร็งซิสพลาตินที่เพิ่มมากขึ้น สำหรับการแพร่กระจายของมะเร็งนั้น สาร DS-1 มีฤทธิ์ยับยั้งการเพิ่มตัวของเซลล์มะเร็งปอดอย่างได้ผลเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มเป้าหมาย พฤติกรรมรุนแรงของเซลล์มะเร็ง เช่น ความสามารถในการแพร่กระจายและความสามารถในการรุกรานเซลล์อื่นได้ถูกลดระดับลงอย่างมากในเซลล์ที่ได้รับสาร DS-1 นอกจากนี้ การวิเคราห์การเจริญเติบโตที่ไม่ต้องอาศัยเซลล์ยึดเกาะได้พิสูจน์ว่า สาร DS-1 สามารถระงับการเจริญเติบโตของเซลล์มะเร็งที่เกิดจากการยึดเกาะ โดยเห็นผลจากการลดจำนวนลงอย่างมีนัยของขนาดและจำนวนเซลล์ ในกระบวนการทำงาน ผู้วิจัยพบว่าสาร DS-1 สามารถสยบการเปลี่ยนสภาพเซลล์ โดยเห็นได้จากการลดจำนวนลงของตัววัดการเปลี่ยนสภาพเซลล์ที่เรียกว่าเอ็น-แคดเฮริน, รูปแบบ Snail และ Slug ในขณะที่ตัววัดค่า อี-แคดเฮรินมีค่ามากขึ้น ทั้งนี้ สาร DS-1 ยังแสดงให้เห็นถึงการลดลงของระดับโมเลกุล integrin B1 ด้วยหลักฐานที่พบนั้นทำให้พิสูจน์ได้ว่า สาร DS-1 สามารถเป็นตัวยับยังโปรตีน MDM2 และการป้องกันการแพร่กระจายของเนื้อร้ายโดยผ่านทางการระงับโมเลกุล integrin และ โปรตีน FAK ซึ่งอาจจะเป็นประโยชน์ต่อการพัฒนาส่วนผสมนี้เพื่อใช้ในการรักษาโรคมะเร็งปอดได้
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
Putri, Hardyanti Eka, "3,4-dihydroxy-5,4’-dimethoxybibenzyl sensitizes non-small cell lung cancer cells to cisplatin-induced apoptosis via p53 upregulation" (2021). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 4856.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/4856