Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
การผลิตและทำบริสุทธิ์ของแมนแนนโอลิโกแซคคาไรด์และบทบาทในการกระตุ้นการยึดเกาะระหว่างเซลล์เยื่อบุ
Year (A.D.)
2018
Document Type
Thesis
First Advisor
Rath Pichyangkura
Second Advisor
Chatchai Muanprasat
Faculty/College
Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)
Department (if any)
Department of Biochemistry (fac. Science) (ภาควิชาชีวเคมี (คณะวิทยาศาสตร์))
Degree Name
Doctor of Philosophy
Degree Level
Doctoral Degree
Degree Discipline
Biochemistry and Molecular Biology
DOI
10.58837/CHULA.THE.2018.6
Abstract
Mannan Oligosaccharide (MOS) is well-known as prebiotic supplement that help increasing life quality of livestocks and animals. Many reports revealed that MOS supplement can help improve intestinal morphology, enhancing growth performance, raising body weight, and increasing metabolic and stress response. MOS feeding also affected several biological processes in peripheral blood mononuclear cells in pigs and modulates expression of many immune-related genes that helps to prevent and reduce the severity of viral infection. However, the mechanism of action of MOS is remained unclear and the production, purification, identification of bioactive MOS molecular type is needed. In this study, we developed a method for mannan oligosaccharide (MOS) production by using a recombinant mannanase. We found that the reaction can be performed in the wide range of temperature and pH, from 4 to 80 degree celcius and 2.5 to 10.0, respectively. Interestingly, low manannase concentration at below 1Unit per 1 gram of coconut meal dried weight yielded a higher amount of MOS rather than using a higher enzyme/ substrate ratio. Longer incubation time exceed 18hr also gave smaller oligosaccharides. MOS products were seperated through Biogel P2 column yielding purified MOS from 2 to 9 mers. We have also investigated the biological effects of MOS on prevention and a treatment of an epithelium inflammation models by using Transepithelial electrical resistant (TEER) assay on T84 cells. The results obtained showed that MOS enhanced cells integrity and MOS pentamer (MOS-5) showed the highest activity and the optimum dose was 10 uM with an activating time of 24 hours. The study on tight junction integration recovery with calcium ions switching shown that MOS5 have the ability to reassemble the cells tight junction. A strudy on MOS5 and Dorsomorphine, an AMPK inhibitor, also shown that MOS5 may activate cellular integration through AMPK signaling pathway. The mechanism of action of MOS5 to an integration of cellular tight junction through AMPK was confirmed with western blot analysis. A structure determination of MOS5 was performed by enzyme hydrolytic assay together with mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. The results shown that MOS5 is a galactomannan polymer composed of mannantetrasaccharide with beta-1,4-glycosidic linkage with one galactose unit attached on the second mannose unit from non-reducing end with alpha-1,6-glycosidic linkage.
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
แมนแนน โอลิโกแซคคาไรด์ (MOS) นั้นเป็นที่รู้จักอย่างกว้างขวางในฐานะของอาหารเสริมสำหรับจุลชีพในระบบทางเดินอาหารซึ่ง สามารถเพิ่มคุณภาพของปศุสัตว์ได้เป็นอย่างดี มีหลายรายงานแสดงว่า MOS นั้นสามารถปรับปรุงลักษณะทางกายภาพของลำไส้และเพิ่มการเจริญ เติบโต น้ำหนัก รวมถึงสามารถกระตุ้นระบบเผาผลาญและการตอบสนองต่อความเครียดได้ การให้ MOS เป็นอาหารยังมีผลในการกระตุ้นการทำงานของของระบบต่างๆ และรวมถึงสามารถกระตุ้นการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกันในเซลเม็ดเลือดขาวชนิดนิวเคลียสเดี่ยว ซึ่งสามารถปกป้องและลดการอักเสบที่เกิดจากการติดเชื้อไวรัสได้ในสุกร แต่อย่างไรก็ตามกลไกการทำงานและขนาดที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพของ MOS นั้นยังไม่มีการรายงานออกมาชัดเจน รวมถึงการผลิตและการทำบริสุทธิ์นั้นยังต้องการการพัฒนาต่อไปในอนาคต ในการทดลองนี้ ผู้ทดลองได้พัฒนาเทคนิคในการผลิต MOS โดยใช้รีคอมบิแนนท์แมนแนนเนส ซึ่งพบว่าวิธีการผลิตดังที่ได้รายงานนี้สามารถในผลผลิตของ MOS ในสัดส่วนที่สูงภายใต้ภาวะกรดด่างและอุณหภูมิที่กว้างตั้งแต่ 4-80 องศาเซลเซียสและพีเอช 2.5-10.0 ตามลำดับ และเป็นที่น่าสนใจว่าหากใช้เอนไซม์บ่มกับซับเสตรทในอัตราส่วนที่ต่ำกว่า 1 ยูนิตต่อกรัมของน้ำหนักแห้งของกากมะพร้าวจะสามารถให้ผลผลิต MOS ในสัดส่วนที่ดีกว่าการใช้อัตราส่วนที่สูงการบ่มปฏิกิริยาที่นานกว่า 18 ชั่วโมงก็ยังให้ผลผลิตเป็นโอลิโกแซคคาไรด์ขนาดเล็กมากขึ้นเช่นกัน โดย MOS ขนาดต่างๆได้ถูกแยกผ่านคอลัมน์ Biogel P2 โดยแยกขนาดได้ถึง 2 ถึง 9 เมอร์ ในส่วนของฤทธิ์ทางชีวภาพ ผู้ทดลองยังได้ศึกษาผลของ MOS ในการกระตุ้นการยึดติดกันของเซลล์เนื้อเยื่อผ่านเทคนิคการวัดความต้านทานไฟฟ้าระหว่างเนื้อเยื่อ (TEER) โดยใช้เซล T84 เป็นตัวอย่าง โดยผลการทดลองที่ได้พบว่า MOS นั้นมีฤทธิ์ในการเพิ่มการยึดเกาะระหว่างเซลล์โดย MOS เพนตาเมอร์ (MOS5) นั้นให้ผลที่ดีที่สุดที่ความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ และให้ผลการกระตุ้นที่ดีที่สุดที่ 24 ชั่วโมง การศึกษาผลของ MOS ต่อกลไกการฟื้นฟูสภาพเชื่อมต่อของเซลล์พบว่า MOS5 นั้นสามารถฟื้นฟูสภาพเชื่อมต่อของเซลล์ที่ถูกทำลายได้อย่างมีนัยสำคัญ และ MOS5 อาจทำการเพิ่มการยึดเกาะของเซลล์ผิวผ่านกลไกการเกิดฟอสโฟรีเลชั่นของ AMPK ซึ่งสมมติฐานนี้ได้ถูกสนับสนุนด้วยผลการทดลองที่ศึกษาการกระตุ้นด้วย MOS5 ควบคู่กับการยับยั้งวิถีของ AMPK โดยใช้ Dorsomorphine นอกจากนี้ ผลการวิเคราะห์การแสดงออกของ AMPK ด้วยวิธี western blot พบว่า MOS5 สามารถเพิ่มอัตราการเกิดฟอสโฟรีเลชั่นของ AMPK ได้อย่างมีนัยสำคัญ การศึกษาโครงสร้างของ MOS5 ด้วยการใช้การย่อยด้วยเอนไซม์ร่วมกับเทคนิค Nuclear magnetic resonance และ Mass spectrometry พบว่า MOS5 ประกอบไปด้วยโครงสร้างหลักคือแมนโนสเทโทรสที่ยึดกันด้วยพันธะเบต้า-1,4-ไกลโคซิดิก และมีกาแลกโตสหนึ่งหมู่ เกาะที่บริเวณแมนโนสหมู่ที่สองจากด้าน non-reducing ด้วยพันธะอัลฟ่า-1,6 ไกลโคซิดิก
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
Nopvichai, Chatchai, "Production and purification of mannan oligosaccharide and its role in tight junction assembly in epithelial cells" (2018). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 2137.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/2137