Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

การพัฒนาวิธีพีซีอาร์เอนไซม์ลิงค์อิมมูโนซอบเบนเพื่อตรวจภาวะเมธิลเลชั่นของยีนแอลวันของเชื้อไวรัสแปปิโลมาชนิด 16

Year (A.D.)

2019

Document Type

Thesis

First Advisor

Arkom Chaiwongkot

Second Advisor

Parvapan Bhattarakosol

Faculty/College

Graduate School (บัณฑิตวิทยาลัย)

Degree Name

Master of Science

Degree Level

Master's Degree

Degree Discipline

Medical Microbiology

DOI

10.58837/CHULA.THE.2019.356

Abstract

It has been well known that cervical cancer is caused by persistent infections with the high risk human papillomavirus (HR-HPV) especially HPV16 and 18. However, a minority of HR-HPV infected women developed cancer, therefore, triage test is necessary to particularly select some HR-HPV infected women who are at higher risk to progress to cervical cancer quickly for colposcopy examination. Since HPV16 L1 gene hypermethylation has been reported to be correlated well with high grade cervical lesions and cancer, the present study aims to develop PCR-ELISA for detection of HPV16 L1 gene methylation. Cervical cells were collected from women who referred for colposcopy in Chulalongkorn memorial hospital. Cobas4800 and REBA-ID assays were used to discriminate HPV 16 positive samples from other types. Of 207 samples, seventy samples resulted in HPV16 positive with histology confirmed as CIN1-3 and other abnormality. All seventy samples were used to perform bisulfite conversion and HPV16 L1 PCR to detect methylation at CpGs5600, 5606, 5609 and 5615. Twenty-six PCR positive samples (130 bps) were used in pyrosequencing assay to evaluate methylation profile which were then used as reference data for PCR-ELISA development. Methylation level >20% was detected at CpGs 5600 and 5609 of CIN2/3, while <10% methylation was mostly found in CIN1 samples. For PCR-ELISA assay optimization, different concentration of reagents was performed. Although final protocol was successfully optimized, but non-specific binding was observed when testing with 0% methylated DNA. Thus, the protocol at streptavidin and amplicons-probe hybrids binding step was changed from 37 °C to 60 °C as the same as hybridization temperature to prevent non-specific binding. We found that at adjusted protocol, the absorbance was lower in DNA concentration 10-100 ng, but still high in 1,000 ng. The final optimized protocol for further experiments was as followed: the hybridization temperature was 60◦C, 2 microgram/well of streptavidin, 294 ng/well of DIG-labelled probe and 1:3200 of antibody dilution, the binding step temperature was 60 °C. The detection limitation of CaSki DNA (approximately 100% methylation) was as low as 10 ng, however, to reduce the non-specific binding, the amplicons concentration must be lower than 1000 ng to efficiently differentiate between unmethylated and methylated CpG. It was noted that the concentrations used in standard curve controls and samples should be the same to obtain reliable absorbance for calculation of methylation percentage. The sensitivity of PCR-ELISA was as low as 20% methylation that absorbance value was higher than value obtained from 0% methylated amplicons and was consistent with pyrosequencing result (21%). Samples with 20% methylation detected by pyrosequencing assay showed methylation value 9.5% when detected by developed PCR-ELISA assay, thus, it can be indicated that clinical sample which represents methylation percentage equal or more than 10% by PCR-ELISA assay, might consider as hypermethylation sample (>20%) with CIN2+. All clinical samples’ DNA concentration was approximately 600 ng. Thus, standard DNA controls concentration 600 ng/microliter were used to set standard curves. Twenty-six samples which were previously analysed for methylation profile by pyrosequencing assay, were used to perform PCR-ELISA. Number of CIN1 and CIN2/3 samples that showed calculated PCR-ELISA methylation percentage similar to pyrosequencing assay was 71.43% (10/14) and 80% (8/10), respectively. When, percentage of methylation at 10% was used as cut-off in the present developed PCR-ELISA method, the sensitivity and the specificity would account for 50% and 71.43%, respectively. However, clinical samples used in present study is limited. Thus, the larger sample size is needed to achieve more accurate specificity and sensitivity.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

ไวรัสฮิวแมนแปปิลโลมาเป็นเชื้อไวรัสไม่มีเปลือกหุ้มชั้นนอก มีเปลือกหุ้มชั้นในเป็นลักษณะแบบเหลี่ยมลูกบาศก์เรียงตัวแบบสมมาตรกัน ห่อหุ้มสารพันธุกรรมที่เป็นดีเอ็นเอสายคู่ขดเป็นวงกลม เป็นที่รู้อย่างกว้างขวางว่ามะเร็งปากมดลูกนั้น มีสาเหตุหลักเกิดจากไวรัสฮิวแมนแปปิลโลมาชนิดความเสี่ยงสูง โดยส่วนใหญ่เกิดจากชนิด 16 และ 18 อย่างไรก็ตาม มีผู้หญิงจำนวนน้อยที่ติดเชื้อไวรัสชนิดความเสี่ยงสูงแล้วพัฒนาไปเป็นมะเร็ง การคัดกรองจึงมีความสำคัญมากในการคัดแยกผู้ที่ติดเชื้อไวรัสชนิดความเสี่ยงสูงและมีความเสี่ยงในการเป็นมะเร็ง เพื่อที่จะตรวจด้วยวิธีการส่องกล้องต่อไป ปัจจุบันมีรายงานหลายฉบับบันทึกว่าการเกิดภาวะเมธิลเลชั่นสูงตรงยีนแอลหนึ่งของเชื้อไวรัสแปปิลโลมาชนิด 16 มีความสัมพันธ์กับการพบเซลล์ปากมดลูกผิดปกติและเซลล์มะเร็ง การศึกษานี้จึงมีจุดประสงค์ในการพัฒนาวิธีพีซีอาร์อีไลซ่า เพื่อที่จะตรวจภาวะเมธิลเลชั่นตรงยีนแอลหนึ่งของเชื้อไวรัสแปปิลโลมาชนิด 16 โดยผู้วิจัยได้เก็บตัวอย่างเซลล์ปากมดลูกจากผู้ที่เข้ารับการส่องกล้องในโรงพยาบาลจุฬาลงกรณ์ และทำการตรวจหาชนิดของไวรัสฮิวแมนแปปิลโลมาโดยใช้วิธีของ Cobas4800 และ Reba-ID จากนั้นเลือกเฉพาะไวรัสชนิด 16 มาทำการทดสอบต่อไป โดยในตัวอย่าง 207 ราย มีตัวอย่าง 70 ราย ที่มีผลเป็นไวรัสชนิด 16 และมีความผิดปกติของเนื้อเยื่อแบบต่างๆ และผู้วิจัยได้นำตัวอย่างทั้ง 70 รายมาทำ bisulfite conversion และพีซีอาร์ที่จำเพาะต่อยีนแอลหนึ่งของเชื้อไวรัสแปปิลโลมาชนิด 16 เพื่อที่จะตรวจหาการเกิดภาวะเมธิลเลชั่นที่ CpG ตำแหน่ง 5600, 5606, 5609 และ 5615 ผู้วิจัยพบว่าตัวอย่างจำนวน 26 รายเท่านั้นที่ให้ผลเป็นบวก (130 bps) จึงได้นำตัวอย่างกลุ่มนี้ไปทำไพโรซีเควนซิ่งซึ่งเป็นการตรวจหาร้อยละของภาวะเมธิลเลชั่นที่เป็นที่ยอมรับในปัจจุบัน และผลที่ได้จะถูกใช้เป็นค่าอ้างอิงร้อยละการเกิดภาวะเมธิลเลชั่นในการพัฒนาเทคนิคพีซีอาร์อีไลซ่า เมื่อตรวจหาร้อยละของภาวะเมธิลเลชั่นด้วยวิธีไพโรซีเควนซิ่ง พบว่าที่ CpG ตำแหน่ง 5600 และ 5609 ของตัวอย่างที่มีผลเนื้อเยื่อเป็น CIN2/3 มีภาวะเมธิลเลชั่นมากกว่าร้อยละ 20 ในขณะที่ตัวอย่างที่มีผลเนื้อเยื่อเป็น CIN1 มีภาวะเมธิลเลชั่นน้อยกว่าร้อยละ 10 ในการพัฒนาเทคนิคพีซีอาร์อีไลซ่าผู้วิจัยได้หาสภาวะที่เหมาะสม โดยทดสอบกับความเข้มข้นที่ต่างกันในสารต่างๆ และถึงแม้จะได้สภาวะที่เหมาะสมแล้ว แต่เมื่อทำการทดสอบกับตัวอย่างที่ไม่มีภาวะเมธิลเลชั่น พบว่าเกิดการจับแบบไม่จำเพาะระหว่างดีเอ็นเอในตัวอย่างกับ DIG-labelled probe ผู้วิจัยจึงปรับอุณหภูมิในขั้นตอนการจับระหว่าง amplicons-probe hybrids กับ streptavidin จาก 37 องศาเซลเซียส เป็น 60 องศาเซลเซียส เพื่อที่จะลดการจับแบบไม่จำเพาะ พบว่าที่ 60 องศาเซลเซียส ค่าการดูดกลืนแสงลดลงเมื่อใช้ดีเอ็นเอที่มีความเข้นข้น 10 ถึง 100 นาโนกรัม แต่ที่ 1,000 นาโนกรัม ยังคงให้ค่าการดูดกลืนแสงที่สูง โดยสุดท้ายได้ผลการพัฒนา ดังนี้ อุณหภูมิในการทำปฏิกิริยา hybridization ที่ 60 องศาเซลเซียส, streptavidin 2 ไมโครกรัมต่อหลุม, DIG-labelled probe 294 นาโนกรัมต่อหลุม, antibody dilution 1:3200 และอุณหภูมิในการอินคูเบท DNA-probe กับ streptavidin คือ 60 องศาเซลเซียส ผู้วิจัยยังได้ทำการตรวจวัดขีดจำกัดของการตรวจตัวอย่างที่มีการเกิดภาวะเมธิลเลชั่นร้อยละหนึ่งร้อย พบว่าตัวอย่างดีเอ็นเอที่มีความเข้มข้น 10 นาโนกรัมเป็นขีดจำกัดของการตรวจ แต่เพื่อที่จะลดการจับแบบไม่จำเพาะ จึงควรใช้ตัวอย่างที่มีความเข้มข้นน้อยกว่า 1000 นาโนกรัม เพื่อที่จะแยกตัวอย่างที่ไม่เกิดภาวะเมธิลเลชั่นออกจากตัวอย่างที่มีการเกิดภาวะเมธิลชั่น และความเข้มข้นของตัวอย่างมาตรฐานกับความเข้มข้นของตัวอย่าง ควรเป็นความเข้มข้นที่ใกล้เคียงกัน เพื่อให้ได้ค่าการดูดกลืนแสงและผลการคำนวณร้อยละการเกิดภาวะเมธิลเลชั่นที่น่าเชื่อถือ ในการทดสอบความไว ผู้วิจัยพบว่าตัวอย่างที่มีการเกิดภาวะเมธิลชั่นร้อยละ 20 มีค่าการดูดกลืนแสงสูงกว่าตัวอย่างที่ไม่มีการเกิดภาวะเมธิลชั่น และมีค่าใกล้เคียงกับผลที่ได้จากวิธีไพโรซีเควนซิ่ง (ร้อยละ 21) ซึ่งตัวอย่างที่มีการเกิดภาวะเมธิลชั่นร้อยละ 20 ที่ตรวจวัดด้วยวิธีไพโรซีเควนซิ่ง ให้ผลการเกิดภาวะเมธิลชั่นร้อยละ 9.5 เมื่อตรวจด้วยวิธีพีซีอาร์อีไลซ่า ดังนั้นตัวอย่างที่มีผลการเกิดภาวะเมธิลชั่นที่ได้จากวิธีพีซีอาร์อีไลซ่าเท่ากับหรือมากกว่าร้อยละ 10 จึงน่าจะสัมพันธ์กับตัวอย่างที่มีรอยโรคตั้งแต่ CIN2 ขึ้นไป ซึ่งมีการเกิดภาวะเมธิลชั่นที่สูง (มากกว่าร้อยละ 20) ในการทดสอบกับตัวอย่าง ผู้วิจัยได้ใช้ตัวอย่างมาตรฐานที่มีความเข้มข้น 600 นาโนกรัม ซึ่งเป็นความเข้มข้นที่ใกล้เคียงกับตัวอย่างพีซีอาร์ส่วนมาก (500-600 นาโนกรัม) สุดท้ายผู้วิจัยได้ทำการตรวจวัดการเกิดภาวะเมธิลเลชั่นด้วยวิธีพีซีอาร์อีไลซ่ากับตัวอย่างจำนวน 26 ตัวอย่าง ซึ่งมีผลร้อยละการเกิดภาวะเมธิลเลชั่นจากวิธีไพโรซีเควนซิ่งก่อนหน้านี้ พบว่าจำนวนตัวอย่างที่มีผลการเกิดภาวะเมธิลเลชั่นที่คำนวณได้จากการทำพีซีอาร์อีไลซ่าใกล้เคียงกับวิธีไพโรซีเควนซิ่ง ในตัวอย่างที่มีรอยโรคแบบ CIN1 และ CIN2/3 คิดเป็นร้อยละ 71.43 (10/14) และ 80 (8/10) ตามลำดับ และเมื่อพิจารณาให้การเกิดภาวะเมธิลเลชั่นร้อยละ 10 เป็นเกณฑ์แยกระหว่าง CIN1 และ CIN2/3 ในการศึกษานี้ พบว่ามีความไวร้อยละ 50 และความจำเพาะสูงถึงร้อยละ 80 อย่างไรก็ตามการศึกษานี้มีประชากรที่ใช้ศึกษาจำนวนน้อย ดังนั้นในอนาคตจึงควรเพิ่มขนาดประชากรให้มากกว่านี้ เพื่อให้ได้ความไวและความจำเพาะของวิธีพีซีอาร์อีไลซ่าที่น่าเชื่อถือ

Download

Share

COinS
 
 

To view the content in your browser, please download Adobe Reader or, alternately,
you may Download the file to your hard drive.

NOTE: The latest versions of Adobe Reader do not support viewing PDF files within Firefox on Mac OS and if you are using a modern (Intel) Mac, there is no official plugin for viewing PDF files within the browser window.