Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
การพัฒนาชุดตรวจแอนติเจนของเชื้อเลปโตสไปราสายพันธุ์ก่อโรคด้วยเทคนิค Lateral Flow Immunoassay โดยอาศัยอนุภาคทองคำระดับนาโน
Year (A.D.)
2017
Document Type
Thesis
First Advisor
Kanitha Patarakul
Second Advisor
Amornpun Sereemaspun
Faculty/College
Graduate School (บัณฑิตวิทยาลัย)
Degree Name
Master of Science
Degree Level
Master's Degree
Degree Discipline
Medical Microbiology
DOI
10.58837/CHULA.THE.2017.349
Abstract
Leptospirosis, caused by pathogenic Leptospira spp., is a global re-emerging zoonosis and endemic disease in tropical and sub-tropical countries including Thailand. Point-of-care testing (POCT) for rapid diagnosis of leptospirosis is needed for prompt and appropriate treatment particularly in resource-poor settings. Lateral flow immunoassay (LFA)-based POCT devices are rapid, user friendly, cheap, have one-step analysis, and need no sophisticated equipment. LipL32 is a common target for diagnostic tests of leptospirosis because it is the major outer membrane protein (OMP) that is specific and highly conserved among pathogenic Leptospira. This study aimed to develop the gold nanoparticle (AuNP)-based LFA for detection of pathogenic leptospiral antigen. To develop the LFA, this study used two clones of anti-LipL32 mouse monoclonal antibodies (mAb3 and mAb82) and a rabbit anti-LipL32 polyclonal antibody (pAb) that showed specific binding to all 22 reference pathogenic Leptospira serovars found in Thailand and did not bind to 2 non-pathogenic serovars. These mAb3 and mAb82 bind different epitopes on LipL32 as demonstrated by the competitive inhibition-based enzyme-linked immunosorbent assay. The lowest limit of detection (LoD) was achieved by the LFA comprising anti-LipL32 mAb82-conjugated AuNPs on the conjugate pad and the anti-LipL32 pAb on the test line. Different sizes of AuNPs including 10, 20, 30 and 40 nm in diameter were successfully synthesized by seeded growth synthesis using citrate reduction. The LoD of 40-nm mAb82-conjugated AuNPs was 100- and 10-fold lower than that of 20-nm and 30-nm AuNPs, respectively, to detect sonicated L. interrogans serovar Pomona spiked in sera. In the present study, the lowest LoD obtained after various optimization of anti-LipL32 mAb82-conjugated AuNP-based LFA was 5 x 103 cells of whole cell lysates in sera. This AuNP-based LFA was evaluated with acute sera from patients with leptospirosis and unrelated diseases. Pretreatment of sera with 4.5% Tween 20 improved the sensitivity of the LFA from 6% (3 of 50) to 24% (12 of 50) to detect acute phase sera from known cases of leptospirosis. Negative detection was observed in all 30 (100%) pretreated and untreated sera of patients with unrelated diseases and healthy person resulting in 100% specificity of this LFA. The new strategies are required to improve the sensitivity of this potential anti-LipL32 mAb82 conjugated AuNP-based LFA for better diagnosis of acute phase leptospirosis in the future.
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
โรคเลปโตสไปโรซิสซึ่งมีสาเหตุจากเชื้อเลปโตสไปราสายพันธุ์ก่อโรค เป็นโรคติดต่อจากสัตว์สู่คนที่เกิดอุบัติซ้ำ มีการแพร่กระจายทั่วโลกและมักเป็นโรคประจำถิ่นของประเทศ โดยเฉพาะอย่างยิ่งบริเวณเขตร้อนและกึ่งเขตร้อนรวมถึงประเทศไทย การตรวจทางห้องปฏิบัติการ ณ จุดดูแลผู้ป่วย (Point-of-Care Testing, POCT) อาศัยเครื่องมือในการตรวจวินิฉัยโรคอย่างง่าย เพื่อให้การวินิฉัยโรคอย่างรวดเร็วและให้การรักษาผู้ป่วยอย่างเหมาสม โดยเฉพาะอย่างยิ่งในพื้นที่ขาดแคลนเครื่องมือ ชุดแถบตรวจโรคแบบแลทเทอรัลโฟลว์ (Lateral flow immunoassay, LFA) เป็นเครื่องมือที่ให้ผลการวิเคราะห์ที่รวดเร็ว ใช้ง่าย ราคาถูก มีขั้นตอนเดียวในการวิเคราะห์ และไม่จำเป็นต้องใช้เครื่องมือที่ยุ่งยากซับซ้อน ลิโพโปรตีนของเชื้อเลปโตสไปราขนาด 32 กิโลดาลตัน หรือโปรตีน LipL32 เป็นโปรตีนเป้าหมายที่นิยมนำมาใช้เพื่อพัฒนาชุดตรวจโรคในรูปแบบต่างๆสำหรับวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซิส เนื่องจาก LipL32 เป็นโปรตีนสำคัญหลักของผนังเซลล์ชั้นนอกที่จำเพาะต่อเชื้อเลปโตสไปราสายพันธุ์ก่อโรคเป็นส่วนใหญ่ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาชุดตรวจหาแอนติเจนของเชื้อเลปโตสไปราสายพันธุ์ก่อโรคด้วยชุดแถบตรวจโรคแบบแลทเทอรัลโฟลว์โดยอาศัยอนุภาคทองคำระดับนาโน โดยใช้แอนติบอดีที่จำเพาะต่อโปรตีน LipL32 ได้แก่ โมโนโคลนอลแอนติบอดีผลิตในหนู โคลนที่ 3 และ 82 และโพลีโคลนอลแอนติบอดีผลิตในกระต่าย ซึ่งสามารถจับอย่างจำเพาะต่อเชื้อเลปโตสไปราสายพันธุ์ก่อโรคที่เป็นสายพันธุ์อ้างอิงในประเทศไทยทั้งหมด 22 ซีโรวาร์ แต่ไม่จับกับเชื้อเลปโตสไปราสายพันธุ์ไม่ก่อโรคทั้ง 2 ซีโรวาร์ การวิเคราะห์ด้วยเทคนิค competitive inhibition-based enzyme-linked immunosorbent assay พบว่าโมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนที่ 3 และ 82 จับเอพิโทปที่แตกต่างกันบนโปรตีน LipL32 จากการศึกษานี้พบว่าชุดแถบตรวจโรคแบบแลทเทอรัลโฟลว์ที่ประกอบด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อโปรตีน LipL32 โคลน 82 ติดบนอนุภาคทองคำระดับนาโน (anti-LipL32 mAb82 conjugated AuNPs) แล้วตรึงบน conjugate pad กับโพลีโคลนอลแอนติบอดีต่อโปรตีน LipL32 ที่ตรึงบนแถบทดสอบ (test line) ให้ผลการทดสอบดีที่สุด กล่าวคือให้ปริมาณต่ำสุดที่ตรวจพบได้ (limit of detection, LoD) มีค่าต่ำที่สุดเมื่อเทียบกับรูปแบบอื่น ในงานวิจัยนี้สามารถสังเคราะห์อนุภาคทองคำระดับนาโนเมตรด้วยวิธี seeded growth synthesis ได้ขนาดแตกต่างกันคือ 10, 20, 30 และ 40 นาโนเมตร จากการทดสอบอิทธิพลของขนาดอนุภาคทองคำระดับนาโนต่อความไว (sensitivity) ของชุดแถบตรวจโรคนี้ พบว่าอนุภาคทองคำระดับนาโนขนาด 40 นาโนเมตรซึ่งติดด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลนที่ 82 สามารถตรวจพบเชื้อเลปโตสไปราสายพันธุ์ก่อโรคที่เติมลงในตัวอย่างซีรัมได้ในปริมาณที่น้อยกว่า 10 และ 100 เท่า เมื่อเทียบกับใช้อนุภาคทองคำระดับนาโน ขนาด 30 และ 20 นาโนเมตร ตามลำดับ ในงานวิจัยนี้พบว่าชุดแถบตรวจโรคแบบแลทเทอรัลโฟลว์ที่ได้จากการปรับสภาวะที่เหมาะสมแล้ว สามารถตรวจพบเชื้อเลปโตสไปราสายพันธุ์ก่อโรคในตัวอย่างซีรัมได้น้อยที่สุดเท่ากับ 5 x 103 เซลล์ นอกจากนี้ เมื่อทดสอบเบื้องต้นด้วยตัวอย่างซีรัมจากผู้ป่วยโรคเลปโตสไปโรซีสระยะเริ่มต้นและซีรัมจากผู้ป่วยโรคต่างๆ ที่ไม่เกี่ยวข้อง เพื่อประเมินประสิทธิภาพของชุดแถบตรวจโรคแบบแลทเทอรัลโฟลว์นี้ พบว่าเมื่อมีการเตรียมตัวอย่างซีรัมของผู้ป่วยก่อนทดสอบด้วย Tween 20 ที่ความเข้มข้นสุดท้ายประมาณร้อยละ 4.5 สามารถเพิ่มความไวของชุดแถบตรวจโรคนี้ได้เมื่อเทียบกับตัวอย่างที่ไม่ได้เตรียมด้วย Tween20 โดยเพิ่มจากร้อยละ 6 (ผลบวก 3 ใน 50 ตัวอย่าง) เป็นร้อยละ 24 (ผลบวก 12 ใน 50 ตัวอย่าง) นอกจากนี้ พบว่าผลการทดสอบเป็นลบในทุกตัวอย่างซีรัมของผู้ป่วยโรคที่ไม่เกี่ยวข้องและคนสุขภาพดี ทั้งตัวอย่างที่มีการเตรียมและไม่ได้เตรียมด้วย Tween 20 ดังนั้น ชุดแถบทดสอบนี้มีความจำเพราะ (specificity) ร้อยละ 100 อย่างไรก็ตาม ชุดแถบตรวจโรคแบบแลทเทอรัลโฟลว์ที่พัฒนาขึ้นในการศึกษานี้ยังมีความไวต่ำ ดังนั้น จึงจำเป็นต้องนำกลยุทธ์ใหม่ๆ มาพัฒนาประสิทธิภาพของชุดแถบตรวจโรคต้นแบบนี้ให้มีความไวเพิ่มขึ้นในการตรวจจับแอนติเจนของเชื้อเลปโตสไปราในตัวอย่างผู้ป่วย เพื่อให้สามารถใช้ตรวจวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซิสในระยะเริ่มต้นได้ดียิ่งขึ้นต่อไปในอนาคต
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
Lae-ngee, Prayoon, "Development of gold nanoparticle-based lateral flow immunoassay for detection of pathogenic leptospiral antigen" (2017). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 839.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/839