Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

ความเกี่ยวข้องของสัญญาณ Notch ในแมโครฝาจจากคนที่ถูกกระตุ้นด้วยอินเตอร์ลิวคิน-4

Year (A.D.)

2017

Document Type

Thesis

First Advisor

Tanapat Palaga

Faculty/College

Graduate School (บัณฑิตวิทยาลัย)

Degree Name

Doctor of Philosophy

Degree Level

Doctoral Degree

Degree Discipline

Medical Microbiology

DOI

10.58837/CHULA.THE.2017.347

Abstract

Macrophages respond to various stimuli, resulting in distinct effector phenotypes that range from LPS-stimulated proinflammatory to IL-4-activated pro-healing phenotype. The regulatory mechanism of this polarization is not fully understood. Notch signaling pathway is a conserved signaling pathway involved in polarization of macrophages, especially proinflammatory macrophages. However, the role of Notch signaling in IL-4 stimulated macrophages (M(IL-4)) is not well defined. PPARgamma is a signature nuclear receptor in M(IL-4) that function mainly in regulating lipid metabolism. There are many reports that revealed the interaction of Notch signaling and PPARgamma in various cells but not in macrophages. In this study, the interaction between Notch signaling and PPARgamma in M(IL-4) using THP-1 cell line and primary human monocytes derived macrophages was investigated. M(IL-4) activated Notch signaling that required the activity of g-secretase to cleave Notch1 receptor. Notch1 intracellular domain (NIC1) overexpressing THP-1 increased PPARgamma expression in the presence or absence of IL-4. Furthermore, g-secretase inhibitor pretreated M(IL-4) decreased PPARgamma level. In contrast, overexpression of dominant negative mastermind-like (DNMAML), a dominant negative for Notch signaling, in M(IL-4) had no effect on PPARgamma level. NIC1 overexpression increased PPARgamma stability by delayed proteasome degradation but not the mRNA transcription or stability. RNAseq was performed to obtain global insight of Notch signaling in M(IL-4). NIC1 overexpressing M(IL-4) showed enrichment of proinflammatory gene sets consistent with previous reports. More importantly, some gene sets of pro-healing macrophages were enriched as well. Network analysis revealed the links between Notch and PPARgamma through NEDD4L, an E3 ubiquitin ligase and SGK1, which has 45-55% of catalytic domain similar to AKT. Deletion of NEDD4L in the presence of NIC1 overexpression in M(IL-4) reduced PPARG mRNA expression. This reduction of PPARG mRNA was accompanied by decreasing AKT phosphorylation. These results indicated that Notch signaling required NEDD4L for optimal expression of PPARG mRNA. Activation of Notch signaling increased lipid metabolism in M(IL-4) by increasing lipid accumulation via CD36 uptake mechanism. Collectively, this study provides evidences linking Notch signaling and PPARgamma via protein stabilization and NEDD4L mediated PPARG regulation and its effect on lipid uptake. The results obtained in this study indicated that Notch signaling operates in both proinflammatory and pro-healing macrophages.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

แมโครฝาจตอบสนองต่อสิ่งเร้าต่างๆ หลากหลาย ซึ่งส่งผลให้มีฟีโนไทปด์ที่แตกต่างกันอย่างหลากหลายตั้งแต่แมโครฝาจที่เอื้อต่อการอักเสบที่ถูกกระตุ้นโดยลิโปโพลีแซ็กคาไรด์ ไปจนถึงแมโครฝาจที่เอื้อต่อการสมานรักษาที่กระตุ้นโดยอินเตอร์ลิวคิน 4 กลไกการควบคุมฟีโนไทปด์เหล่านี้ยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด วิถีสัญญาณ Notch เป็นวิถีสัญญาณที่มีการอนุรักษ์ไว้ในสายวิวัฒนาการและมีการรายงานว่า เกี่ยวข้องกับการตอบสนองของแมโครฝาจ โดยเฉพาะอย่างยิ่งแมโครฝาจที่เอื้อต่อการอักเสบ บทบาทของวิถีสัญญาณ Notch ในแมโครฝาจที่กระตุ้นด้วย IL-4 (M(IL-4)) นั้น ยังไม่เป็นที่ทราบกันแน่ชัด PPARgamma เป็นหนึ่งในเอกลักษณ์โปรตีนชนิดนิวเคลียร์รีเซพเตอร์ ทำหน้าที่หลักในการควบคุมการสร้างและสลายไขมันของ M(IL-4) มีหลายรายงานที่ได้กล่าวถึงปฎิสัมพันธ์กันระหว่างวิถีสัญญาณ Notch และ PPARgamma ในเซลล์หลายชนิดแต่ไม่พบรายงานในแมโครฝาจ งานวิจัยนี้จึงศึกษาการอันตรกิริยาของสัญญาณระหว่าง Notch และ PPARgamma ใน M(IL-4) โดยใช้เซลล์ไลน์ THP-1 และเซลล์แมโครฝาจปฐมภูมิ พบว่า M(IL-4) มีการกระตุ้นวิถีสัญญาณ Notch ซึ่งต้องอาศัยแอคทิวิตีของเอนไซม์ g-secretase ในการตัด Notch1 รีเซพเตอร์ ในภาะที่มีการแสดงออกเกินของ Notch1 intracellular domain (NIC1) พบว่า มี PPARgamma มากขึ้นทั้งที่มีและไม่มี IL-4 นอกจากนี้การใช้ตัวยับยั้งเอนไซม์ gamma-secretase ก่อนกระตุ้นด้วย IL-4 ลดการแสดงออกของ PPARgamma ในทางกลับกันเมื่อมีการแสดงออกเกินของโปรตีนที่ทำงานเชิงลบต่อวิถีสัญญาณ Notch ซึ่งคือ dominant negative mastermind-like (DNMAML) ใน M(IL-4) กลับไม่มีผลต่อระดับ PPARgamma การที่เซลล์มีการแสดงออกเกินของ NIC1 เพิ่มความเสถียรของ PPARgamma โดยลดการถูกทำลายจากโปรตีเอโซม แต่ไม่เกี่ยวข้องกับการถอดรหัสหรือความเสถียรของ mRNA การศึกษารูปแบบการเปลี่ยนแปลง RNA โดยวิธี RNAseq ถูกนำมาใช้เพื่อให้เข้าใจผลโดยรวมของวิถีสัญญาณ Notch ใน M(IL-4) พบว่า เมื่อมีการแสดงออกเกินของ NIC1 ใน M(IL-4) พบการเพิ่มชุดยีนที่เกี่ยวข้องกับการอักเสบที่ได้มีรายงานมาก่อนหน้านี้ ที่สำคัญกว่านั้นพบว่ามีการเพิ่มขึ้นของยีนในกลุ่มการสมานรักษาด้วยเช่นกัน จากการวิเคราะห์เครือข่ายความเชื่อมโยง (network analysis) เปิดเผยให้เห็นถึงความเชื่อมโยงกันระหว่าง Notch และ PPARgamma ผ่าน NEDD4L ซึ่งเป็น E3 ubiquitin ligase ชนิดหนึ่ง และ SGK1 ที่มีส่วนที่ทำงาน (catalytic domain) คล้ายคลึงกับ AKT ถึง 45-55% เมื่อตัดยีน NEDD4L ออก ภายใต้ภาวะที่มีการแสดงออกเกินของ NIC1 ใน M(IL-4) พบว่ามีการลดการแสดงออกของ PPARG mRNA ร่วมกันนี้ยังลด AKT phosphorylation ผลการศึกษานี้บ่งชี้ว่า วิถีสัญญาณ Notch จำเป็นต้องมี NEDD4L เพื่อการการถอดรหัสที่เหมาะสมของ PPARgamma การกระตุ้นวิถีสัญญาณ Notch ยังส่งผลถึงกระบวนการเมตาบอลิซึมของไขมันใน M(IL-4) โดยเพิ่มการสะสมของไขมันผ่านกลไลการนำเข้าเซลล์ของ CD36 โดยรวมแล้วการศึกษานี้แสดงหลักฐานให้เห็นความเชื่อมโยงของ Notch และ PPARgamma ด้วยการทำให้โปรตีนเสถียรขึ้นและใช้ NEDD4L เป็นตัวกลางการควบคุมยีน PPARgamma และผลต่อกระบวนการนำไขมันเข้าสู่เซลล์ ผลที่ได้จากการศึกษานี้บ่งชี้ว่า วิถีสัญญาณ Notch ทำงานในแมโครฝาจทั้งภาวะเอื้อต่อการอักเสบและภาวะเอื้อต่อการสมานรักษา

Download

Share

COinS
 
 

To view the content in your browser, please download Adobe Reader or, alternately,
you may Download the file to your hard drive.

NOTE: The latest versions of Adobe Reader do not support viewing PDF files within Firefox on Mac OS and if you are using a modern (Intel) Mac, there is no official plugin for viewing PDF files within the browser window.