Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

การวิเคราะห์โปรตีโอมในน้ำลายสุนัขที่เป็นโรคเนื้องอกในช่องปากเพื่อการวินิจฉัยโรคและติดตามการรักษา

Year (A.D.)

2019

Document Type

Thesis

First Advisor

Gunnaporn Suriyaphol

Second Advisor

Anudep Rungsipipat

Third Advisor

Chanin Kalpravidh

Faculty/College

Faculty of Veterinary Science (คณะสัตวแพทยศาสตร์)

Department (if any)

Department of Anatomy (fac. Veterinary Science) (ภาควิชากายวิภาคศาสตร์ (คณะสัตวแพทยศาสตร์))

Degree Name

Doctor of Philosophy

Degree Level

Doctoral Degree

Degree Discipline

Veterinary Biosciences

DOI

10.58837/CHULA.THE.2019.1607

Abstract

Tumors of the oral cavity account for 8% of all canine neoplasia. Malignant oral mass such as melanoma, oral squamous cell carcinoma (OSCC) and fibrosarcoma covers approximately 59% of canine oral neoplasia. Among these, canine oral melanoma (COM) is the most common oral tumors in dogs, with approximately 30–40% of all oral tumors. With high recurrence and/or distant metastasis rate, biomarkers are required for early detection, diagnosis, prognosis, and monitoring treatment response. Since saliva directly contacts tumors and saliva collection is non-invasive, easily accessible and cost effective, salivary biomarkers are suitable to support the evaluation of oral diseases. This study aimed to investigate novel salivary peptide mass fingerprints (PMFs), clusters, and feasible biomarkers in dogs with oral tumors using proteomic techniques. A total of 62 canine salivary samples from 5 early-stage oral melanoma (EOM), 24 late-stage oral melanoma (LOM), 10 OSCC, 11 oral benign tumors (BN), 7 normal and 5 periodontitis (age range 7–14 years) were subjected to matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) coupled with liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry (LC-MS/MS) and in-gel digestion coupled with liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry (GeLC-MS/MS). The principle component analysis (PCA) plot of MALDI-TOF MS showed a combined cluster of normal and periodontitis groups as a control group (CP), whereas other clusters of tumors were separated as EOM, LOM, OSCC and BN. Moreover, the PMFs of MALDI-TOF MS revealed specific peptide peaks which their peptide sequences were identified by LC-MS/MS and were compared with mammalian protein databases using a Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) program. Western blot analysis was used to verify the protein expressions of sentrin-specific protease 7 (SENP7) in OSCC, toll-like receptor 4 (TLR4) and its related protein, nuclear factor kappa B (NF-kB), in LOM and OSCC. The protein bands of SENP7, TLR4 and NF-kB from western blot analysis were verified by LC-MS/MS. Western blot analysis was then carried on in individual samples, showing enhanced expression of SENP7, TLR4 and NF-kB in LOM and OSCC. For the GeLC-MS results, the levels of tyrosine phosphatase non-receptor type 5 (PTPN5) were significantly increased in all tumor groups with prominent expression in LOM and OSCC. Western blot analysis was used to confirm the expression of protein tyrosine phosphatase non-receptor type 5 (PTPN5) and tumor protein p53 (p53), associated with PTPN5 in a PTPN5-chemotherapy drug interaction, in all tumor groups with marked expression in LOM. Peptide sequences of PTPN5 and p53 western blot analysis were verified by LC-MS/MS. Furthermore, in-solution digestion and LC-MS/MS were used to investigate biomarkers for monitoring treatment response in 12 COM with the pre-surgery stage (PreS), with post-surgery stage (PostS), after treatment with carboplatin for 1–6 times [After treatment (AT)1–AT6] and during follow-up care for 1–4 times (C1–4). Patients were then divided into those with short-term survival (STS) (less than 12 months after surgery) and long-term survival (LTS) (more than 12 months after surgery). With LC-MS/MS, the expression of a potential salivary biomarker, ubiquitin D (UBD), was observed in PreS, PostS, AT1–6, and C1–4. Western blot analysis verified the increased ratio of free UBD (fUBD) to conjugated UBD (cUBD) expression in PreS in the STS group. Moreover, the levels of fUBD was significantly enhanced in PreS compared with AT2 in the STS group. In conclusion, different clusters and peptide fragment masses in PMF were observed among EOM, LOM, OSCC, BN and CP, showing the potential for rapid screening of the diseases. Using MALDI-TOF MS coupled with LC-MS/MS approaches, SENP7, TLR4, and NF-kB were shown to be conceivable salivary biomarkers. Using GeLC-MS/MS technique, PTPN5 and its partner, p53 were suggested to be candidate salivary biomarkers. In addition, with in solution digestion and LC-MS/MS method, a ratio of fUBD to cUBD in PreS was discovered to be a plausible prognostic biomarker for survival in canine oral melanoma. The expression of innovative potential salivary biomarkers was confirmed by western blot analysis and peptide sequences from the western blot analysis was verified by LC-MS/MS.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

เนื้องอกในช่องปากสุนัขเป็นเนื้องอกที่พบได้บ่อยประมาณ 8% ของเนื้องอกทั้งหมด โดยมีทั้งเนื้องอกธรรมดา (oral benign tumors, BN) และมะเร็ง พบสุนัขเป็นมะเร็งช่องปากเมลาโนมา (oral melanoma, OM) มะเร็งช่องปากสแควมัสเซลล์คาร์ซิโนมา (oral squamous cell carcinoma, OSCC) และมะเร็งช่องปากไฟโบซาโคมาร์ประมาณ 59% ของสุนัขที่เป็นเนื้องอกในช่องปากทั้งหมด เป็นที่ทราบกันดีว่า OM นั้นเป็นมะเร็งที่พบมากที่สุด ประมาณ 30-40% ของสุนัขที่เป็นมะเร็งช่องปากทั้งหมด มะเร็งชนิดนี้มีความรุนแรงมากบริเวณตำแหน่งรอยโรคและยังสามารถแพร่กระจายไปยังอวัยวะอื่นในเวลาอันรวดเร็ว ส่วน OSCC นั้นพบประมาณ 20-30% รองลงมาจาก OM มีความรุนแรงเฉพาะตำแหน่งที่เกิดโรค เนื่องจากมะเร็ง(ช่องปาก)มีความรุนแรงดังที่ได้กล่าวไป การหาดัชนีชี้วัดทางชีวภาพ (biomarkers) สำหรับสำหรับสุนัขที่เป็นมะเร็งช่องปากจึงเป็นสิ่งจำเป็น เพื่อใช้ในการตรวจโรคในระยะเริ่มต้น การวินิจฉัยโรค การพยาการณ์โรค และการตรวจติดตามโรคหลังการรักษา ตัวอย่างจากน้ำลายมีความเหมาะสมในการใช้ตรวจหาดัชนีชี้วัดทางชีวภาพสำหรับโรคมะเร็งช่องปาก เพราะน้ำลายสัมผัสโดยตรงกับก้อนเนื้องอกในช่องปาก นอกจากนั้นยังสามารถเก็บตัวอย่างได้ง่าย ไม่ทำให้สัตว์เกิดความเจ็บปวด และมีค่าใช้จ่ายไม่แพง การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อใช้น้ำลายสุนัขที่เป็นเนื้องอกช่องปากแบบต่างๆ ในการวิเคราะห์รูปแบบ peptide mass fingerprint (PMF) การจัดกลุ่มที่จำเพาะต่อโรค และการหาดัชนีชี้วัดทางชีวภาพ โดยใช้เทคนิคทางโปรติโอมิกส์ โดยทำการเก็บตัวอย่างน้ำลายจากสุนัขทั้งหมด 62 ตัว อายุเฉลี่ย 7-14 ปี โดยแบ่งออกเป็น 6 กลุ่ม ดังนี้ มะเร็งช่องปากเมลาโนมาในระยะคลินิกระยะแรก (ระยะที่ 1 และ 2) (early-stage OM, EOM) จำนวน 5 ตัว มะเร็งช่องปากเมลาโนมาในระยะคลินิกระยะท้าย (ระยะที่ 3 และ 4) (late-stage OM, LOM) จำนวน 24 ตัว OSCC จำนวน 10 ตัว BN จำนวน 11 ตัว สุนัขที่มีสุขภาพช่องปากปกติจำนวน 7 ตัว และสุนัขที่เป็นโรคปริทันต์จำนวน 5 ตัว (control and periodontitis, CP) โดยมีการใช้เทคนิคทางโปรติโอมิกส์ คือ การใช้ Matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) ร่วมกับ Liquid chromatograph mass spectrometry/mass spectrometry (LC-MS/MS) และอีกวิธีหนึ่งคือการย่อยโปรตีนภายในเจล (in-gel digestion) ร่วมกับวิธี Liquid chromatograph mass spectrometry/mass spectrometry (GeLC-MS/MS) จากการใช้เทคนิค MALDI-TOF MS ร่วมกับ LC-MS/MS แสดงผลกราฟสามมิติ Principal component analysis (PCA plot) พบว่ากลุ่มตัวอย่างแต่ละกลุ่มมีรูปแบบการกระจายตัวของเปปไทด์เป็นแบบเกาะกลุ่มแยกจากกันอย่างชัดเจน ยกเว้นกลุ่มสุนัขที่มีสุขภาพช่องปากปกติและสุนัขที่เป็นโรคปริทันต์นั้นมีรูปแบบการกระจายตัวรวมเป็นกลุ่มเดียวกัน (Control and Periodontitis: CP) เปปไทด์ที่มีความเฉพาะในแต่ละกลุ่มจะถูกนำมาวิเคราะห์หาลำดับกรดอะมิโน (amino acid sequencing) เพื่อนำไปเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลโปรตีนของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม โดยใช้โปรแกรม Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) จากนั้นทำการตรวจสอบการแสดงออกของโปรตีนที่คาดว่าจะเป็นดัชนีชี้วัดทางชีวภาพด้วยวิธี western blot พบว่ามีการแสดงออกของ Sentrin-specific protease 7 (SENP7) ในตัวอย่างน้ำลายจากกลุ่ม OSCC และพบการแสดงออกของ Toll-like receptor 4 (TLR4) และ Nuclear factor kappa B (NF-kB) ซึ่งมีความสัมพันธ์กับ TLR4 ในกลุ่ม LOM และ OSCC สุดท้ายทำการตรวจสอบความจำเพาะของโปรตีนจาก western blot โดยใช้วิธี LC-MS/MS อีกครั้งหนึ่ง นอกจากนี้ยังได้นำวิธี western blot มาใช้ตรวจสอบการแสดงออกของโปรตีนทั้ง 3 ชนิด ในตัวอย่างน้ำลายจากสุนัขทุกตัว และพบว่าโปรตีน SENP7 TLR4 และ NF-kB มีการแสดงออกอย่างเด่นชัดในกลุ่ม LOM และ OSCC สำหรับผลจากการใช้วิธี GeLC-MS/MS พบว่า Protein tyrosine phosphatase non-receptor type 5 (PTPN5) มีปริมาณสูงในกลุ่ม LOM และ OSCC นอกจากนี้ยังพบ Tumor protein p53 (p53) ในเครือข่ายความสัมพันธ์ระหว่าง PTPN5 และยาเคมีบำบัด ซึ่งเมื่อใช้วิธี western blot ตรวจสอบพบว่า PTPN5 และ p53 มีการแสดงออกมากในทุกกลุ่ม แต่จะเด่นชัดที่สุดในกลุ่ม LOM จากนั้นทำการตรวจสอบความจำเพาะของโปรตีนจาก western blot โดยใช้วิธี LC-MS/MS อีกครั้งหนึ่ง นอกจากนี้ผู้วิจัยยังได้ศึกษาการแสดงออกของโปรตีนในน้ำลายสุนัขที่เป็น OM จำนวน 12 ตัว ที่ได้รับการรักษาด้วยวิธีการผ่าตัดและทำการรักษาต่อเนื่องโดยใช้ยาเคมีบำบัดชนิด carboplatinเพื่อเป็นการหาดัชนี้ชี้วัดทางชีวภาพในการตรวจติดตามโรค (treatment monitoring) โดยใช้วิธีย่อยโปรตีนในสารละลาย (in-solution digestion) ร่วมกับวิธี LC-MS/MS ตัวอย่างน้ำลายจะถูกแบ่งออกเป็น 2 กลุ่ม คือ กลุ่มที่เสียชีวิตภายใน 12 เดือนหลังผ่าตัด (Short-term survival, STS) และกลุ่มที่มีชีวิตรอดนานกว่า 12 เดือนหลังผ่าตัด (Long-term survival, LTS) ผลการศึกษาพบการแสดงออกของ Ubiquitin D (UBD) ในตัวอย่างน้ำลายก่อนผ่าตัด หลังผ่าตัด ทำเคมีบำบัดครั้งที่ 1 ถึง 6 และในช่วงติดตามการรักษาหลังทำเคมีบำบัดครั้งที่ 1 ถึง 4 และจากการใช้เทคนิค western blot วิเคราะห์การแสดงออกของ Free UBD (fUBD) และ Conjugated UBD (cUBD) และอัตราส่วนของ fUBD ต่อ cUBD พบว่าสุนัขกลุ่มSTS มีอัตราส่วน fUBD ต่อ cUBD สูงกว่าสุนัขกลุ่ม LTS นอกจากนี้ยังพบว่าโปรตีน fUBD ในตัวอย่างน้ำลายกลุ่ม STSที่เก็บก่อนการผ่าตัดมีการแสดงออกมากกว่าตัวอย่างหลังจากสุนัขได้รับยาเคมีบำบัดครั้งที่สอง จากการศึกษานี้สรุปได้ว่าผลการวิเคราะห์ PMF และกราฟสามมิติ PCA plot สามารถแบ่งกลุ่มของสุนัขออกเป็น 5 กลุ่มดังนี้ EOM LOM OSCC BN และ CP แสดงถึงความเป็นไปได้ในการนำเทคนิคนี้มาใช้ตรวจกรองโรคอย่างรวดเร็วในทางคลินิกปฏิบัติ (rapid screening test) จากการศึกษาดัชนี้ชี้วัดทางชีวภาพในน้ำลายสุนัขที่เป็นเนื้องอกช่องปากโดยใช้เทคนิคทางโปรติโอมิกซ์โดยใช้วิธี MALDI-TOF MS ร่วมกับ LC-MS/MS พบว่าโปรตีน SENP7, TLR4, และ NF-kB มีความเป็นไปได้ที่จะเป็นดัชนีชี้วัดทางชีวภาพที่มีประสิทธิภาพ และเมื่อใช้วิธี GeLC-MS พบความเป็นไปได้ในการใช้ PTPN5 และ p53 ในการประกอบการวินิจฉัยโรคสุนัขกลุ่มที่มีเนื้องอกในช่องปาก นอกจากนี้ในการตรวจติดตามโรค OM ที่เข้ารับการรักษาด้วยวิธีการผ่าตัดและเคมีบำบัดนั้น พบว่าดัชนีชี้วัดที่มีประสิทธิภาพในการตรวจติดตามโรคหลังการรักษา คือ UBD โดยมีความเป็นไปได้ในการใช้อัตราส่วนระหว่าง fUBD และ cUBD ในการพยากรณ์โรคและพยากรณ์อัตราการรอดชีวิตของสุนัขที่เป็นมะเร็งช่องปากชนิดเมลาโนมา

Download

Share

COinS
 
 

To view the content in your browser, please download Adobe Reader or, alternately,
you may Download the file to your hard drive.

NOTE: The latest versions of Adobe Reader do not support viewing PDF files within Firefox on Mac OS and if you are using a modern (Intel) Mac, there is no official plugin for viewing PDF files within the browser window.