Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

GENETIC MODIFICATION OF Escherichia coli FOR L-LACTIC ACID PRODUCTION

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

การปรับปรุงทางพันธุกรรมของ Escherichia coli เพื่อผลิตกรดแอล-แลกติก

Year (A.D.)

2016

Document Type

Thesis

First Advisor

Ruethairat Boonsombat

Faculty/College

Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)

Degree Name

Master of Science

Degree Level

Master's Degree

Degree Discipline

Biotechnology

DOI

10.58837/CHULA.THE.2016.1348

Abstract

Lactic acid is a chemical compound that has been used in many industrial applications. Therefore, effective process of lactic acid production is required to meet the higher demand of PLA plastic. The lactic acid can be produced by microbial fermentation including lactic acid bacteria (LAB) and fungi. Currently, Rhizopus oryzae has been interested due to its pure L(+)-lactic acid production. However, without additional applications, its morphology is difficult to control during fermentation process because its mycelium can cause a problem in stirred-tank bioreactor. To overcome such problem, genetic engineering technique for generating genetically modified Escherichia coli will be used. In this research, the gene replacement method and applied different plasmid system were used. According to a limitation of gene replacement technique, the DNA fragment for L(+)-lactic acid production was designed by containing ORF of R. oryzae ldhA gene flanked by upstream and downstream region of E. coli ldhA gene and planned to replace E. coli chromosomal ldh gene by linear transformation technique with plasmid pKD46. However, the construction of DNA fragment for gene replacement was unsuccessful. For applied different plasmid system, the pUC19 and pBluescript II KS(+) were used to harbor R. oryzae ldhA gene. The recombinant E. coli strains were fermented at 37 oC for 48 hours under anaerobic condition. The recombinant E. coli strain name TW2 which applied pUC19 vector harboring R. oryzae ldhA gene was successfully produced L(+)-lactic acid with higher yield and LDH activity, but lower intracellular pyruvate concentration than RB24 (pBluescript II KS(+) harboring R. oryzae ldhA gene). The better performances than pBluescript II KS(+) vector on ldhA expression may resulted from lower promoter strength. However, L(+) lactic acid production from TW2 strain was lower than wild type strain. This may come from the function of the other lactate dehydrogenase (LLDH) in wild type strain, and the shift to other fermentative pathways in TW2 strain.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

กรดแลกติกเป็นสารประกอบอินทรีย์ที่พบได้ในธรรมชาติซึ่งถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางในอุตสาหกรรมต่างๆ ทำให้ความต้องการของกรดแลกติกมีแนวโน้มที่จะเพิ่มสูงขึ้นอีกในอนาคต จึงได้เกิดการพัฒนาสายพันธุ์ของจุลินทรีย์ที่มีประสิทธิภาพในการผลิตกรดแลกติก และคุ้มค่าในการผลิต กรดแล็กติก สามารถผลิตได้จากการหมักของจุลินทรีย์เช่น แบคทีเรียผลิตกรดแลกติกและ เชื้อรา ในปัจจุบันเชื้อรา Rhizopus oryzae กำลังเป็นที่น่าสนใจเนื่องจากมันสามารถผลิตกรดแอล-แลกติกไอโซเมอร์แอลบริสุทธิ์ได้ แต่อย่างไรก็ตาม ในระหว่างการหมักโดยไม่มีอุปกรณ์เสริมการควบคุมลักษณะสัณฐานวิทยาของเชื้อราพันธุ์นี้จะสามารถทำได้ยาก เนื่องจากไมซีเลียมของราสามารถก่อให้เกิดปัญหากับถังปฏิกรณ์ชีวภาพแบบกวนได้ ในการที่จะแก้ปัญหาเหล่านี้ เทคนิคในการตัดต่อพันธุกรรมจึงถูกนำมาใช้เพื่อปรับปรุงสายพันธุ์ Escherichia coli ในโครงการวิจัยนี้จะใช้เทคนิกการแทนที่ยีน และการใช้พาหะที่แตกต่างกัน ตามขีดจำกัดของเทคนิกการแทนที่ยีนแล้ว การออกแบบชิ้นส่วนดีเอ็นเอสำหรับการผลิตกรดแอล-แลกติกจะประกอบด้วยส่วน open reading frame (ORF) ของยีน ldhA จาก R. oryzae ขนาบข้างโดยส่วน upstream และ downstream ของยีน ldhA จาก E. coli และวางแผนที่จะแทนที่ยีน ldhA บนโครโมโซมของ E. coli โดยการส่งถ่ายชิ้นส่วนยีนเข้าสู่ผู้รับด้วยพลาสมิด PKD46 อย่างไรก็ตามในการสร้างชิ้นส่วนดีเอ็นเอเพื่อการแทนที่ยีนนั้นไม่ประสบผลสำเร็จ สำหรับการใช้พาหะที่แตกต่างกันพลาสมิด pUC19 และ pBluescript II KS(+) จะถูกนำมาใช้ให้รับยีน ldhA จาก R. oryzae ทำการหมักเชื้อ E. coli ที่ดัดแปลงจากวิธีการทั้งสองด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีกลูโคส 2% ที่ 37 0C ภายใต้สภาวะที่ไม่มีออกซิเจน เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เชื้อ E. coli สายพันธุ์ TW2 ซึ่งมีพาหะ pUC19 ซึ่งมียีน ldhA จากเชื้อรา R. oryzae ประสบผลสำเร็จในการผลิตกรดแอลแลกติก และยังมีกิจกรรมของยีน ldh ที่มากกว่า แต่มีน้ำตาลไพรูเวทที่เหลือภายในเซลล์น้อยกว่า เชื้อ E. coli สายพันธุ์ RB24 (พาหะ pBluescript II KS(+) ซึ่งมียีน ldhA จากเชื้อรา R. oryzae) ประสิทธิภาพที่ดีกว่า pBluescript II KS(+) ในด้านการแสดงออกของยีน ldhA อาจจะเป็นผลจากความแข็งแกร่งของตัวควบคุมการแสดงออกที่น้อยกว่า อย่างไรก็ตามการผลิตกรดแอล-แลกติกของสายพันธุ์ TW2 สายพันธุ์ดั้งเดิม ซึ่งอาจเกิดจากการทำงานของ lactate dehydrogenase (LLDH) ตัวอื่นในสายพันธุ์ดั้งเดิม และการเปลี่ยนไปเส้นทางการหมักอื่นของสายพันธุ์ TW2

Link to Full Text

Share

COinS