Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

ภาวะที่เหมาะสมของภาวะการเลี้ยงเชื้อเพื่อผลิตซีโครปิน เอ ในรีคอมบิแนนต์ Pichia pastoris

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

Optimization of culture conditions for production of Cecropin A in recombinant Pichia pastoris

Year (A.D.)

2015

Document Type

Thesis

First Advisor

ศรินทิพ สุกใส

Second Advisor

กิตตินันท์ โกมลภิส

Faculty/College

Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)

Degree Name

วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Degree Level

ปริญญาโท

Degree Discipline

เทคโนโลยีชีวภาพ

DOI

10.58837/CHULA.THE.2015.811

Abstract

ซีโครปิน เอ (cecropins A, CA) เป็นเพปไทด์ต้านจุลินทรีย์ที่พบในระบบภูมิคุ้มกันในน้ำเลือด (immune hemolymph) ของผีเสื้อกลางคืน Hyalophora cecropia มีฤทธิ์ฆ่าจุลินทรีย์ได้ทั้งแกรมบวก และ แกรมลบ รวมถึงมีฤทธิ์ในการยับยั้งการเกิดเนื้องอกและต้านเซลล์มะเร็ง อย่างไรก็ตามการสกัด ซีโครปิน เอ จากผีเสื้อกลางคืนทำได้ยากเนื่องจากจะมีการปนเปื้อนของโปรตีนที่ไม่ต้องการ ดังนั้นในงานวิจัยนี้จึงศึกษาการผลิตซีโครปิน เอ ในระบบของยีสต์ P. pastoris โดยทำการศึกษาใน ยีสต์ P. pastoris 3 สายพันธุ์ คือ X33 (Mut+), GS115 (Mut+ His-) และ KM71H (MutS) และหาภาวะที่เหมาะสมในการผลิต ด้วยเทคนิค Real time PCR พบว่า ยีสต์ทั้ง 3 สายพันธุ์ มีระดับการแสดงออกของยีน (gene expression) ที่ดีที่สุดในภาวะ ค่ากรด -ด่างที่ 6 อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส และ ระดับความเข้มข้นของเมทานอล 0.5 เปอร์เซ็นต์ รีคอมบิแนนต์ซีโครปิน เอ ที่ผลิตได้ถูกนำมาทำให้บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์โครมาโตกราฟีแบบแยกตามความจำเพาะโดยใช้คอลัมน์ฮีสแทรบฟาสท์โฟลว์ (His trap Fast Flow) ซึ่งมีความจำเพาะกับรีคอมบิแนนต์ซีโครปิน เอ ที่ต่อด้วยฮีสธิดีน จากนั้นตรวจสอบปริมาณการผลิตรีคอมบิแนนต์โปรตีนซีโครปิน เอ ใน P. pastoris 3 สายพันธุ์ ที่เลี้ยงที่ภาวะดังกล่าว เป็นเวลา 24 ชั่วโมง พบว่า P. pastoris สายพันธุ์ KM71H และ GS115 มีความสามารถในการผลิตซีโครปิน เอ ได้ใกล้เคียงกัน คือ 4.64 และ 4.29 มิลลิกรัมต่อลิตร ตามลำดับ ส่วน X33 ผลิตได้เพียง 2.79 มิลลิกรัมต่อลิตร

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

Cecropin A (CA) is an antimicrobial peptide found in immune hemolymph of moths Hyalophora cecropia. It has ability to kill both Gram-positive and Gram-negative microbes and also to inhibit tumor and cancer cells. However, it is difficult to extract CA from moths because of contamination of unwanted proteins. Therefore, in this research, production of CA in yeast Pichia pastoris strains was investigated. Three strains of yeast P. pastoris: X33 (Mut+), GS115 (Mut+ His-), and KM71H (MutS) were studied. The optimized conditions for production were revealed by Real time PCR technique that all three strains of P. pastoris gave high relative gene expression at pH 6, 30 degree Celsius and 0.5 percent methanol. The produced recombinant CA was purified by His trap Fast Flow affinity chromatography which is specific to the recombinant CA linked with histidine tag. Then, the concentrations of the recombinant CA produced at the optimum condition 24 h by all three strains of P. pastoris were quantified. The results showed that P. pastoris strain KM71H and GS115 could produce the similar amount of the recombinant CA at 4.64 and 4.29 mg/L, respectively, while X33 produced only at 2.79 mg/L.

Link to Full Text

Share

COinS