Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

Overexpression of lipase from aureobasidium pullulans var. melanogenum sry14-3 and fusarium solani in pichia pastoris and application for wastewater pretreatment

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

การแสดงออกเกินปกติของไลเพสจาก Aureobasidium pullulans var. melanogenum SRY14-3 และ fusarium solani ใน pichia pastoris และการประยุกต์สำหรับการบำบัดน้ำเสียขั้นต้น

Year (A.D.)

2014

Document Type

Thesis

First Advisor

Warawut Chulalaksananukul

Faculty/College

Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)

Degree Name

Doctor of Philosophy

Degree Level

Doctoral Degree

Degree Discipline

Biotechnology

DOI

10.58837/CHULA.THE.2014.865

Abstract

The purpose of this study was to clone a lipase gene from Aureobasidium melanogenum and Fusarium solani for increasing lipase production via Pichia pastoris expression system, determine the properties of lipase and apply the recombinant P. pastoris expressing lipase for lipid-containing wastewater pretreatment. The genes of A. melanogenum lipase (AML) and F. solani lipase (FSL) were successfully expressed in P. pastoris using inducible expression system and constitutive expression system under the control of alcohol oxidase 1 promoter (pAOX1) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter (pGAP), respectively. Both of them produced more lipase than the wild-type. The recombinant Pichia expressing AML obtained using the inducible promoter (P. pastoris/pPICZαA-AML) showed specific lipase activity of 9.9 U/mg after 6 days of 2% v/v methanol induction. Optimal lipase activity was observed at 35–37 °C and pH 7.0 using p-nitrophenyl laurate as the substrate. Lipase activity was enhanced by Mg2+, Mn2+, Li+, Ca2+ and Ni2+ (1 mM), DTT and EDTA (5 mM) but was inhibited by Hg2+, Ag+, SDS, Tween 20 and Triton X-100. The recombinant Pichia expressing FSL obtained using the constitutive promoter (P. pastoris/pGAPZαA-FSL) showed the highest specific activity of 18.8 U/mg after 3 days. Optimal lipase activity was observed at 35°C and pH 7.0 usingp-nitrophenyl laurate as the substrate. Lipase activity was enhanced by Mn2+, Ba2+, Li+, Ca2+, Ni2+, CHAPS (1 mM) and Triton X-100 (0.1% and 1% v/v) but was inhibited by Hg2+, Ag+ and SDS. Recombinant lipases from P. pastoris/pPICZαA-AML and P. pastoris/pGAPZαA-FSL were stable in both water-miscible and water-immiscible organic solvents. The addition of 10% v/v of octanol andp-xylene increased activity of both lipases. For application in wastewater pretreatment, cultivation of P. pastoris/pGAPZαA-FSL in synthetic wastewater containing 1% w/v palm oil resulted in degradation of 87% of the oil within 72 h. KM and Vmax value of P. pastoris/pGAPZαA-FSL for palm oil degradation were 1% w/v and 38.4 µM TAG degraded/h/OD600, respectively. From the results, P. pastoris expressing FSL by constitutive expression system could be used as an alternative microorganism for the wastewater pretreatment.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้คือ เพื่อที่จะโคลนยีนไลเพสจาก Aureobasidium melanogenum และ Fusarium solani เพื่อเพิ่มการผลิตไลเพสผ่านระบบการแสดงออกของ Pichia pastoris, ตรวจสอบคุณสมบัติของไลเพส และประยุกต์ใช้รีคอมบิแนนท์ P. pastoris ที่มีการแสดงออกของไลเพสในการบำบัดน้ำเสียขั้นต้นที่มีไขมันเป็นองค์ประกอบ ยีนไลเพสของ A. melanogenum (AML) และ F. solani (FSL) สามารถแสดงออกได้อย่างสำเร็จใน P. pastoris โดยใช้ระบบการแสดงออกแบบเหนี่ยวนำ และระบบการแสดงออกแบบตลอดเวลา ภายใต้การควบคุมของโพรโมเตอร์แอลกอฮอล์ออกซิเดส1 (pAOX1) และโพรโมเตอร์กลีเซอรอลดีไฮด์-3-ฟอสเฟต ดีไฮโรจีเนส (pGAP) ตามลำดับ ทั้งสองระบบสามารถผลิตไลเพสได้มากกว่าสายพันธุ์ดั้งเดิม รีคอมบิแนนท์ Pichia ที่มีการแสดงออกของ AML ซึ่งได้มาจากโพรโมเตอร์ที่มีการแสดงออกแบบเหนี่ยวนำ (P. pastoris/pPICZαA-AML) พบว่า มีค่าแอกทิวิทีจำเพาะของไลเพสสูงที่สุดเท่ากับ 9.9 ยูนิตต่อมิลลิกรัมโปรตีน ที่เวลา 6 วัน เมื่อมีการเหนี่ยวนำด้วยเมทานอล 2 เปอร์เซ็นต์โดยปริมาตร ค่าแอกทิวิทีที่เหมาะสม คือ ที่อุณหภูมิ 35 – 37 องศาเซลเซียส และพีเอช 7.0 โดยใช้พารา-ไนโตรฟีนิลลอเรตเป็นสารตั้งต้น ค่าแอกทิวิทีของไลเพสสามารถเพิ่มได้โดยการเติม Mg2+, Mn2+, Li+, Ca2+ และ Ni2+ (1 มิลลิโมลาร์), DTT และ EDTA (5 มิลลิโมลาร์) แต่จะถูกยับยั้งโดย Hg2+, Ag+, SDS, Tween 20 และ Triton X-100 รีคอมบิแนนท์ Pichia ที่มีการแสดงออกของ FSL ซึ่งได้มาจากโพรโมเตอร์ที่มีการแสดงออกแบบตลอดเวลา (P. pastoris/pGAPZαA-FSL) พบว่า มีค่าแอกทิวิทีจำเพาะของไลเพสสูงที่สุดเท่ากับ 18.8 ยูนิตต่อมิลลิกรัมโปรตีน ที่เวลา 3 วัน ค่าแอกทิวิทีที่เหมาะสม คือ ที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส และพีเอช 7.0 โดยใช้พารา-ไนโตรฟีนิลลอเรตเป็นสารตั้งต้น ค่าแอกทิวิทีของไลเพสสามารถเพิ่มได้โดยการเติม Mn2+, Ba2+, Li+, Ca2+, Ni2+, CHAPS (1 มิลลิโมลาร์) และ Triton X-100 (0.1 และ 1 เปอร์เซ็นต์โดยปริมาตร) แต่จะถูกยับยั้งโดย Hg2+, Ag+ และ SDS รีคอมบิแนนท์ไลเพสจาก P. pastoris/pPICZαA-AML และP. pastoris/pGAPZαA-FSL มีความเสถียรทั้งในตัวทำละลายอินทรีย์ที่ละลายน้ำได้และละลายไม่ได้ การเติม octanol และ p-xylene ที่ความเข้มข้น 10 เปอร์เซ็นต์โดยปริมาตร สามารถเพิ่มแอกทิวิทีของไลเพสได้ทั้งคู่ ในการประยุกต์สำหรับการบำบัดน้ำเสียขั้นต้น พบว่า เมื่อเลี้ยง P. pastoris/pGAPZαA-FSL ในน้ำเสียสังเคราะห์ที่มีน้ำมันปาล์ม 1 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนักต่อปริมาตร จะส่งผลให้เกิดการย่อยสลายน้ำมันได้ 87 เปอร์เซ็นต์ ภายใน 72 ชั่วโมง ค่า KM และ Vmax ของ P. pastoris/pGAPZαA-FSL สำหรับการย่อยสลายน้ำมันปาล์ม เท่ากับ 1 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนักต่อปริมาตร และ 38.4ไมโครโมลาร์ของไตรกลีเซอไรด์ที่ถูกย่อยสลายต่อชั่วโมงต่อค่าการดูดกลืนแสงที่ 600 นาโนเมตร ตามลำดับ จากผลการทดลองที่ได้ แสดงให้เห็นว่า P. pastoris ที่มีการแสดงออกของ FSL ในระบบการแสดงออกแบบตลอดเวลา สามารถใช้เป็นจุลินทรีย์ทางเลือกในการบำบัดน้ำเสียขั้นต้นได้

Link to Full Text

Share

COinS