Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

Altering substrate specificity of alpha-amylase by bioimprinting with beta-cyclodextrin

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

การเปลี่ยนแปลงความจำเพาะต่อซับสเตรตของแอลฟาอะไมเลสโดยวิธีไบโออิมพรินทิงด้วยบีตาไซโคลเดกซ์ทริน

Year (A.D.)

2007

Document Type

Thesis

First Advisor

Manchumas Prousoontorn

Second Advisor

Piamsook Pongsawasdi

Faculty/College

Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)

Degree Name

Master of Science

Degree Level

Master's Degree

Degree Discipline

Biochemistry

DOI

10.58837/CHULA.THE.2007.998

Abstract

The aim of this study was to alter the substrate specificity of ∞-amylase by the combination of bioimprinting with ®-cyclodextrin (®-CD) and immobilization method. ∞-Amylase was first derivatized with itaconic anhydride to have enough attachment points for enzyme crosslinking. It was determined that the optimum ratio (w/w) of protein to itaconic anhydride was 1:5 which resulted in derivatization degree of 60.7% and the remaining activity of the derivatized enzyme was 93%. The derivatized ∞-amylase was then bioimprinted with ®-CD and immobilized using ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) and 2,2’-azobis (2-methylpropionitrile) (AIBN). It was found that the optimal condition for bioimprinting process was to incubate 30 mg/ml of ∞-amylase with 25 mg/ml of ®-CD in 50 mM sodium acetate buffer pH 6.0 for 30 minutes. And the optimal condition for crosslinking procedure was to use 10 mg/ml of ∞-amylase suspended in cyclohexane with the addition of 4 mg/ml AIBN and EGDMA at the final concentration of 0.82 M under UV irradiation ([gamma] = 240 nm) for 3 hours. The CDase, cyclization and dextrinizing activity of crosslinked imprinted protein (CLIP-∞-amylase) were investigated. The results obtained suggested that the CDase and cyclization activity of CLIP-∞-amylase could not be generated by imprinting with ®-CD under the investigated conditions. Nevertheless, the dextrinizing activity of CLIP-∞-amylase could be altered. The dextrinizing activity was found to be only 42.4% in comparison with that of the crosslinked form where the enzyme was crosslinked without the imprinted molecule.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อ ทำการศึกษาการเปลี่ยนแปลงความจำเพาะต่อซับสเตรตของแอลฟาอะไมเลส (alpha-amylase) โดยใช้วิธีไบโออิมพรินทิง (bioimprinting) ด้วยบีตาไซโคลเดกซ์ทริน (beta-cyclodextrin, ®-βCD) ร่วมกับวิธีการตรึงเอนไซม์ เมื่อทำการเติมหมู่ไวนิลบนโมเลกุลของเอนไซม์ (derivatization) เพื่อให้มีตำแหน่งเชื่อมต่อที่มากพอในขั้นตอนของการตรึงเอนไซม์ พบว่าอัตราส่วนที่เหมาะสมระหว่างเอนไซม์กับอิทาโคนิคแอนไฮไดรด์เท่ากับ 1:5 ซึ่งทำให้เกิดการเติมหมู่ไวนิล (derivatization degree) เท่ากับ 60.7% และมีแอกทิวิตีคงเหลือ 93% เมื่อทำการไบโออิมพริน (bioimprint) แอลฟาอะไมเลสด้วย ®-CD และตรึงด้วยเอทิลีนไกลคอล ไดเมทาคริเลท (ethylene glycol dimethacrylate, EGDMA) และ 2,2’-เอโซบิส 2-เมทิลโพรพิโอไนตรายล์ (2,2’-azobis (2-methylpropionitrile), AIBN) พบว่าภาวะที่เหมาะสมในการทำไบโออิมพรินทิงคือ บ่มแอลฟาอะไมเลส 30 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร กับ ®-CD เข้มข้น 25 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ในโซเดียมอะซิเตทบัฟเฟอร์เข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ pH 6.0 เป็นเวลา 30 นาที และภาวะที่เหมาะสมในการตรึงเอนไซม์คือ ใช้แอลฟาอะไมเลส 10 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ในไซโคลเฮกเซน แล้วเติม EGDMA ให้มีความเข้มข้นสุดท้ายเป็น 0.82 โมลาร์ และ AIBN 4 มิลลิกรัม บ่มภายใต้แสงยูวีความยาวคลื่น 240 นาโนเมตร เป็นเวลา 3 ชั่วโมง จากนั้นทำการศึกษาปฏิกิริยาการย่อย ®-CD (CDase activity), การสร้าง ®-CD (cyclization activity) และการย่อยแป้ง (dextrinizing activity) ของแอลฟาอะไมเลส ที่ผ่านการทำไบโออิมพรินทิงและการตรึง (crosslinked imprinted protein, CLIP-∞-amylase) ข้อมูลที่ได้บ่งชี้ว่าการทำไบโอ อิมพรินทิงแอลฟาอะไมเลสด้วย ®-CD ไม่สามารถทำให้เอนไซม์ย่อย ®-CD และสร้าง ®-CD ได้ อย่างไรก็ตามพบว่าปฏิกิริยาการย่อยแป้งของ CLIP แอลฟาอะไมเลสมีการเปลี่ยนแปลง โดยเกิดปฏิกิริยาเพียง 42.4% เมื่อเปรียบเทียบกับแอลฟาอะไมเลสรูปแบบที่ทำการตรึงเพียงอย่างเดียวโดยไม่ได้ทำการอิมพรินด้วยลิแกนด์

Link to Full Text

Share

COinS