Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

การเตรียมให้บริสุทธิ์บางส่วนและสมบัติของไคทิเนสจาก Bacillus cereus

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

Partial purification and characterization of chitinase from Bacillus cereus

Year (A.D.)

1999

Document Type

Thesis

First Advisor

พีรดา มงคลกุล

Faculty/College

Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)

Degree Name

วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Degree Level

ปริญญาโท

Degree Discipline

ชีวเคมี

DOI

10.58837/CHULA.THE.1999.609

Abstract

Bacillus sp. ที่ใช้ในการวิจัยนี้เป็น Bacillus cereus สามารถผลิตไคทิเนสและขับไคทิเนสออกสู่อาหารเลี้ยงเชื้อ เมื่อเลี้ยงแบคทีเรียในอาหารเลี้ยงเชื้อสูตรปรับต่ำ ที่มีคอลลอยดัลไคทินเป็นองค์ประกอบอยู่ 0.2 เปอร์เซนต์ ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เมื่อศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างการเจริญและการผลิตไคทิเนส พบว่าแบคทีเรียจะผลิตไคทิเนสได้ก่อนที่จะสังเกตเห็นการเจริญของเซลล์ เอนไซม์จะมีแอคติวิตีสูงสุดที่ 32 ชั่วโมง ซึ่งเป็นช่วงที่เซลล์เข้าสู่ระยะการเจริญคงที่ และระดับเอนไซม์ยังคงสูงอยู่ตลอด 120 ชั่วโมงที่ศึกษา pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมของเอนไซม์อย่างหยาบในการย่อยคอลลอยดัลไคทินคือ 5.0 และ 60-65 องศาเซลเซียส ตามลำดับ การทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์ขึ้นด้วย โครมาโตกราฟีคอลัมน์รีเจนเนอเรทเทดไคทินพบว่ามีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 27.78 เท่า และมีผลผลิตเอนไซม์ 28.89 เปอร์เซนต์ จากการศึกษาสมบัติของไคทิเนสจาก Bacillus sereus หลังจากผ่านคอลัมน์รีเจนเนอเรทเทดไคทินพบว่าไคทิเนสที่เชื้อผลิตได้ สามารถย้อมติดสีย้อมไคทิเนส ในเอสดีเอส-พอลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรฟอรีซีสได้ทั้งหมด 5 แถบ ซึ่งมีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 45 58 60 70 และ 80 กิโลดาลตัน ในขณะที่แยกได้เพียง 2 แถบในดิสค์-พอลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรฟอรีซีส นอกจากนี้ยังพบว่าเอนไซม์มีสมบัติเป็นไกลโคโปรตีน pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมของเอนไซม์ผสม ที่ได้จากการทำให้บริสุทธิ์บางส่วนในการย่อยคอลลอยดัลไคทินคือ 4.0-6.0 และ 40-50 องศาเซลเซียส ตามลำดับ เอนไซม์ค่อนข้างเสถียรในช่วง pH ที่กว้างคือ pH 4-10 เอนไซม์สามารถไฮโดรไลซ์คอลลอยดัลไคทิน รีเจนเนอเรทเทดไคทิน ไกลคอลไคทิน ไคทินผงที่บริสุทธิ์ ไกลคอลไคโตแซน และ flaked chitosan (~90% deacetylation) ได้ดีตามลำดับจากมากไปน้อย และไม่ไฮโดรไลซ์ไคทินผง (ที่ไม่บริสุทธิ์ ขนาด 60 mesh) เซลลูโลส และคาร์บอกซีเมทธิลเซลลูโลส มีค่า Km ของเอนไซม์ต่อการย่อยคอลลอยดัลไคทินเท่ากับ 0.922 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร จากการตรวจสอบชนิดของไคทิเนสพบว่า เอนไซม์มีแอคติวิตีของไคโทไบโอซิเดสและเอ็นโดไคทิเนสในอัตราส่วน 24.60:2.43 และไม่มีแอคติวิตีของเอ็น-อะซิทิลกลูโคซามินิเดส

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

Bacillus sp. was identified to be Bacillus cereus. The bacterium produced chitinases and secreted them into culture medium when the bacterium was grown at 37 ํC in minimum medium supplemented with 0.2% colloidal chitin. Kinetic studies on growth and chitinase production showed that the bacteria synthesized chitinase prior to cell growth. The enzyme activity reached maximum at 32 hr which was early stationary phase. Maximum activity was observed throughout the 120 hr studied. The optimum pH and temperature of the crude enzyme using colloidal chitin as substrate were 5.0 and 60-65 ํC, respectively. Chitinase from the culture supernatant was partially purified up to 27.78 folds with 28.89% yield by regenerated chitin column chromatography. Subsequent studied by activity staining in SDS-PAGE showed 5 active bands with molecular weights of approximately 45, 58, 60, 70 and 80 KDa; whereas there were only 2 active bands from native PAGE. Staining with PAS showed that they were glycoproteins. The optimum pH and temperature of the partially purified enzyme mixture for colloidal chitin were 4.0-6.0 and 40-50 ํC, respectively and was quite stable in a wide pH range between 4 and 10. The enzyme mixture hydrolyzed colloidal chitin, regenerated chitin, glycol chitin, purified chitin, glycol chitosan and 90% deacetylation flaked chitosan but did not hydrolyze powdered chitin (60-mesh), cellulose and carboxymethyl cellulose (CMC). The Km value for colloidal chitin was 0.922 mg.ml-1. Characterization of the enzyme showed that they are endochitinase and chitobiosidase. N-acetylglucosaminidase was not detected in the mixture.

Link to Full Text

Share

COinS