Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
ฤทธิ์ของสารไฮดรอกซีแซนโทนต่อการป้องกันการรั่วไหลของเยื่อบุลำไส้ที่มีผลจากสารสื่ออักเสบที่เกี่ยวข้องกับสารพิษของแบคทีเรีย
Year (A.D.)
2017
Document Type
Thesis
First Advisor
Sutthasinee Poonyachoti
Second Advisor
Chatsri Deachapunya
Faculty/College
Faculty of Veterinary Science (คณะสัตวแพทยศาสตร์)
Department (if any)
Department of Physiology (fac. Veterinary Science) (ภาควิชาสรีรวิทยา (คณะสัตวแพทยศาสตร์))
Degree Name
Master of Science
Degree Level
Master's Degree
Degree Discipline
Animal Physiology
DOI
10.58837/CHULA.THE.2017.6
Abstract
Leaky gut characterized as decreased transepithelial electrical resistance and increased paracellular permeability to macromolecules is associated with several fatal diseases including sepsis. Pro-inflammatory cytokine IL-1β is a critical mediator of underlying mechanism through activation of myosin light chain kinase pathway. Blocking the inducible phosphorylated myosin light chain (p-MLC) indicates the successful treatment. Xanthones predominantly found in mangosteen (Garcinia mangostana) has been indicated as a potent anti-inflammatory action. Hydroxyxanthones (HDX), the major natural xanthones, have been recently synthesized in various forms. This study aimed to examine and screen the action of various forms of synthetic HDXs, in preventing the increased paracellular permeability during challenging with IL-1β by inhibiting the p-MLC expression in an in vitro model of intestinal Caco-2 cell culture. Caco-2 cells were cultivated in standard media with 10% fetal bovine serum for 7 or 21 days representing colonic-like or differentiated jejunal-like intestinal epithelial cells, respectively. Screening of non-cytotoxic forms of HDXs over 24 and 48 h were determined primarily by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. The transepithelial resistance (TER) measured by volt-ohm meter and paracellular permeability of fluorescein isothiocyanate-dextran (FD-4; MW=4,400 Da) were accomplished for evaluating of paracellular permeability. Semi-quantitative Western blot analysis was performed to monitoring of p-MLC protein expression in response to drug treatments. In the MTT assay, all HDXs 1-monoHDX, 1,3-diHDX, 1,3,6-triHDX or 1,3,6,8-tetraHDX at 10 or 100 µM had no cytotoxicity. In an exception, 1,3,6,8-tetraHDX 100 µM decreased the viability of 7-day cell at 48 h. In normal condition, 1-monoHDX or 1,3-diHDX (10 µM) treatment promoted the increased TER in 7-day cells at 12 h, but 1,3-diHDX and 1,3,6-triHDX decreased TER in 21-day cells during 12-48 h. In 7-day cells challenged with IL-1β to decrease TER and increase paracellular permeability of FD-4, 1-monoHDX or 1,3-diHDX at 10 µM restored all the effect of IL-1β on the paracellular permeability at 12 and 24 h (n=5 experiments; p<0.05). In 21-day cells which were not responding to IL-1β, however 1-monoHDX also enhanced the TER from the initial values (p<0.05) at 12 and 24 h. In an accordance, Western blot analysis showed that p-MLC protein expression was increased in IL-1β treatments at 24 h. HDXs decreased the p-MLC stimulated by IL-1β at 24 h. These results suggest that HDXs can protect the increased paracellular permeability induced by IL-1β by inhibiting the increased p-MLC expression in colonic-like cells. In conclusion, 1-monoHDX and 1,3-diHDX at a concentration of 10 µM may be beneficial and be a candidate for treatment of the leaky gut in the future.
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
การรั่วไหลของเยื่อบุลำไส้มีคุณลักษณะที่สำคัญคือมีการเพิ่มการแพร่ของสารโมเลกุลใหญ่ผ่านช่องด้านข้างของเซลล์เยื่อบุเป็นสาเหตุสำคัญของการเสียชีวิตจากโรคติดเชื้อในกระแสโลหิต โดยพบว่ามีสารสื่ออักเสบคือ อินเตอร์ลิวคิน-1เบต้า เป็นตัวกลางที่สำคัญในการกระตุ้นผ่านวิถีการทำงานของไมโอซินไลท์เชนไคเนส ดังนั้นถ้าหากสามารถการยับยั้งการทำงานของกลไกนี้ที่ทำให้เกิดการเหนี่ยวนำการเกิดฟอสโฟรีเลตของไมโอซินไลท์เชน (พี-เอ็มแอลซี) ได้ก็น่าจะประสบความสำเร็จในการรักษาโรคได้ พบว่า แซนโทน ซึ่งเป็นสารที่พบมากในเปลือกของมังคุดมีฤทธิ์ที่ชะงัดในการต้านการอักเสบ โดยในปัจจุบันได้มีการสังเคราะห์สาร ไฮดรอกซีแซนโทน ซึ่งเป็นสารกลุ่มแซนโทนสำคัญที่พบอยู่ในมังคุดได้ในหลายรูปแบบ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อกลั่นกรองและตรวจสอบรูปแบบของสารไฮดรอกซีแซนโทน ที่มีความสามารถออกฤทธิ์ป้องกันการเพิ่มการแพร่ผ่านของสารผ่านช่องด้านข้างของเซลล์เยื่อบุในขณะที่ได้รับอินเตอร์ลิวคิน-1เบต้า โดยการทำงานผ่านการยับยั้งการแสดงออกของพี-เอ็มแอลซีในเซลล์เพาะเลี้ยงของลำไส้ชนิดคาโคทูซึ่งเป็นแบบจำลองนอกตัวสัตว์ เซลล์เพาะเลี้ยงของลำไส้ชนิดคาโคทูถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อ ซึ่งประกอบด้วยซีรั่มจากตัวอ่อนลูกวัว 10 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 7 หรือ 21 วัน เพื่อเจริญต่อเป็นเซลล์ลำไส้ใหญ่หรือมีการพัฒนาเปลี่ยนเป็นเซลล์ลำไส้เล็ก ตามลำดับ เพื่อที่จะหารูปแบบของไฮดรอกซีแซนโทนที่ไม่เป็นพิษที่ 24 และ 48 ชั่วโมงจึงมีการทดสอบความเป็นพิษโดยวิธีเอ็มทีทีก่อนในเบื้องต้น หลังจากนั้นจึงทำการทดลองการแพร่ผ่านของสารผ่านด้านข้างของเซลล์ โดยวัดค่าความต้านทานไฟฟ้าระหว่างเซลล์เยื่อบุโดยเครื่องโวลล์โอห์มมิเตอร์และวัดการแพร่ผ่านของสารเรืองแสงเอฟดีโฟว์ และสุดท้ายจึงทดลองการตอบสนองของยาต่อแสดงออกของโปรตีนพี-เอ็มแอลซีด้วยวิธีการวิเคราะห์แบบเวสเทิร์นบลอท ผลการทดลองจากเอ็มทีทีพบว่า 1-โมโนไฮดรอกซีแซนโทน 1-3-ไดไฮดรอกซีแซนโทน 1,3,6-ไตรไฮดรอกซีแซนโทน และ 1,3,6,8-เตเตระไฮดรอกซีแซนโทน ที่ความเข้มข้น 10-100 ไมโครโมลาร์จะไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์เยื่อบุลำไส้ที่เลี้ยงเป็นเวลา 7 วัน ยกเว้น 1,3,6,8-เตตระไฮดรอกซีแซนโทนความเข้มข้น 100 ไมโครโมลาร์ ที่ 48 ชั่วโมงเท่านั้นที่จะลดการมีชีวิตของเซลล์ ในสภาวะปกติ 1-โมโนไฮดรอกซีแซนโทน หรือ 1,3-ไดไฮดรอกซีแซนโทน จะกระตุ้นการเพิ่มค่าความต้านทานทางไฟฟ้าของเซลล์เยื่อบุที่มีอายุ 7 วัน ที่ 12 ชั่วโมง แต่ 1,3-ไดไฮดรอกซีแซนโทน หรือ 1,3,6-ไตรไฮดรอกซีแซนโทน ที่ความเข้มข้น 100 ไมโครโมลาร์จะลดค่าความต้านทานทางไฟฟ้าของเซลล์เยื่อบุที่มีอายุ 21 วัน ที่ 12 ถึง 48 ชั่วโมง นอกจากนั้นยังพบว่าอินเตอร์ลิวคิน-1เบต้าสามารถเพิ่มการแพร่ผ่านของสารผ่านด้านข้างของเซลล์เยื่อบุที่มีอายุ 7 วัน และเมื่อได้รับสาร 1-โมโนไฮดรอกซีแซนโทน หรือ 1,3-ไดไฮดรอกซีแซนโทน ความเข้นข้น 10 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 12 และ 24 ชั่วโมง จะสามารถฟื้นฟูผลจากอินเตอร์ลิวคิน-1เบต้าได้ ส่วนในการศึกษาเซลล์ที่มีอายุ 21 วัน กลับไม่พบการตอบสนองเมื่อได้รับอินเตอร์ลิวคิน-1เบต้า อย่างไรก็ตามยังคงพบว่า 1-โมโนไฮดรอกซีแซนโทนสามารถกระตุ้นให้เกิดการเพิ่มค่าความต้านทางไฟฟ้าของเซลล์เยื่อบุที่ 12 และ 24 ชั่วโมงได้ ในทิศทางสอดคล้องกัน ผลการวิเคราะห์แบบเวสเทิร์นบลอทพบการแสดงออกของพี-เอ็มแอลซีเพิ่มขึ้นเมื่อมีการกระตุ้นด้วยอินเตอร์ลิวคิน-1เบต้า และถ้าได้รับไฮดรอกซีแซนโทนในเซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วยอินเตอร์ลิวคิน-1เบต้าจะสามารถลดการแสดงออกของโปรตีนพี-เอ็มแอลซีได้ที่ 24 ชั่วโมง จากผลการทดลองทั้งหมดบ่งชึ้ว่า 1-โมโนไฮดรอกซีแซนโทน และ 1,3-ไดไฮดรอกซีแซนโทน ที่ความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ สามารถป้องกันการแพร่ผ่านของสารผ่านด้านข้างของเซลล์เยื่อบุโดยการยับยั้งการแสดงออกของโปรตีนพี-เอ็มแอลซีในเซลล์เยื่อบุลำไส้ใหญ่ จึงทำให้สรุปได้ว่าไฮดรอกซีแซนโทนในรูปแบบของ 1-โมโนไฮดรอกซีแซนโทน และ 1,3-ไดไฮดรอกซีแซนโทน ที่ความเข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์ จะสามารถการนำไปใช้ และอาจถูกคัดเลือกเพื่อเป็นยาที่ใช้รักษาการรั่วไหลของเยื่อบุลำไส้ได้ในอนาคต
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
Chayalak, Wannaporn, "The protective effect of hydroxyxanthone on the leakiness of intestinal epithelia by the proinflammatory cytokine related to bacterial endotoxin" (2017). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 496.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/496