Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

Identification of gene binding with hpv type 16 e7 protein related to promoter methylation in C33A cell line

Year (A.D.)

2018

Document Type

Thesis

First Advisor

ปฐมวดี ญาณทัศนีย์จิต

Faculty/College

Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)

Department (if any)

Department of Botany (ภาควิชาพฤกษศาสตร์)

Degree Name

วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Degree Level

ปริญญาโท

Degree Discipline

พันธุศาสตร์

DOI

10.58837/CHULA.THE.2018.1034

Abstract

โปรตีนอี 7 ที่สร้างจากไวรัสเอชพีวี ไทป์ 16 เป็นสาเหตุหลักที่ทำให้เกิดมะเร็งปากมดลูก จากการศึกษาก่อนหน้านี้พบว่าโปรตีนอี 7 สามารถจับกับโปรตีน DNA methyltransferase 1 (Dnmt1) แล้วจับที่โพรโมเตอร์ของยีน CCNA1 และชักนำให้เกิดเมทิลเลชันและลดการแสดงออกของยีน การศึกษานี้จึงมุ่งเน้นเพื่อหายีนอื่นๆ และกลไกของโปรตีนอี 7 ที่สามารถจับที่บริเวณโพรโมเตอร์ของยีนแล้วชักนำให้เกิดเมทิลเลชันได้ โดยมีสมมติฐานว่า เมื่อโปรตีน E7 จับกับทรานสคริปชันแฟคเตอร์แล้ว จะสามารถจับกับโพรโมเตอร์ของยีนแล้วเหนี่ยวนำให้เกิดเมทิลเลชันได้ โดยในการศึกษานี้ได้ทำการค้นหายีนที่สามารถจับกับโปรตีน อี 7 ของ HPV ไทป์ 16 ด้วย 2 วิธีการ คือ การทำ Chromatin immunoprecipitation Sequencing ด้วยการถ่ายโอนพลาสมิดลูกผสมที่บรรจุยีน E7 เข้าในเซลล์สายพันธุ์มะเร็งปากมดลูก C33A จากนั้นทำการตกตะกอนดีเอ็นเอที่สามารถจับกับโปรตีน E7 แล้วนำมาหาลำดับเบส เพื่อสืบหายีนเป้าหมายของ E7 ซึ่งค้นพบทั้งหมด 3 ยีน ได้แก่ FAM189A1, ASAH2B, และ RAPGEF4 และวิธีการทางชีวสารสนเทศ (Bioinformatics) โดยการใช้ลำดับเบสบริเวณโพรโมเตอร์ของยีน CCNA1 ที่เป็น cis-element ของ AP2 ซึ่งเป็นทรานสคริปชันแฟคเตอร์ที่สามารถจับกับโปรตีน E7 ไปค้นหาในฐานข้อมูลจีโนมมนุษย์เพื่อค้นหาโพรโมเตอร์ของยีนอื่นๆ ที่มี cis-element ตรงกัน จากนั้นคัดเลือกยีนที่มีลำดับเบสบริเวณโพรโมเตอร์ตรงกับลำดับเบสบริเวณโพรโมเตอร์ของยีน CCNA1 ที่ AP2 สามารถจับได้ แล้วนำมาคัดเลือกเฉพาะยีนที่สามารถจับกับทรานสคริปชันแฟคเตอร์ YY1 ซึ่งมีรายงานว่าสามารถจับกับโปรตีน E7 ได้เช่นกัน พบทั้งหมด 9 ยีน ได้แก่ NOP56, MAG, FUS, EIF2S2, RPL7, RPL10, NINJ1, LGALS1 และ CLDN5 แล้วจึงทำการคัดเลือกยีน FAM189A1 และยีน NOP56 เพื่อทำการตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของระดับการแสดงออกของยีน ด้วยเทคนิค Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) ในเซลล์ C33A และ HEK293 ที่มีและไม่มี E7 พบว่ายีน FAM189A1 และยีน NOP56 ในเซลล์ที่มี E7 มีการแสดงออกของยีนลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่ไม่มี E7 และเมื่อทำการตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของระดับการเกิดเมทิลเลชันของยีนด้วยเทคนิค Methylation-specific PCR พบว่าในเซลล์ HEK293 ที่มี E7 เกิดเมทิลเลชันบริเวณโพรโมเตอร์ของยีน FAM189A1 และยีน NOP56 มากขึ้น หลังจากนั้นจึงทำการทดสอบยืนยันการจับกันระหว่างโปรตีน E7, AP2 และ YY1 กับโพรโมเตอร์ของยีน ด้วยวิธี Chromatin immunoprecipitation (ChIP) พบว่า โปรตีน E7, AP2 และ YY1 สามารถจับกับบริเวณโพรโมเตอร์ของยีน FAM189A1 และยีน NOP56 ได้ จากผลการศึกษาทั้งหมดจึงเป็นการยืนยันว่าโปรตีน E7, AP และ YY1 คอมเพลกซ์ สามารถชักนำให้เกิดโพรโมเตอร์เมทิลเลชันของยีนFAM189A1 และยีน NOP56 ได้ โดยผ่านกลไกการจับที่โพรโมเตอร์ของยีนแล้วยับยั้งการแสดงออกของยีน ทำให้การแสดงออกของยีน FAM189A1 และยีน NOP56 ลดลง

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

E7 protein generated by Human papillomavirus (HPV) type 16 is the main cause of cervical cancer. The previous report showed that E7 protein interacted with DNA methyltransferase 1 (Dnmt1) and bound with CCNA1 promoter inducing CCNA1 methylation and decreasing expression of gene. The purposes of this research are to identify genes that E7 can drive the promoter methylation and to prove the mechanism by which E7 induce promoter methylation. Aaccording to assume that when E7 protein interacts with transcription factor, It can bind to the gene promoter and induce methylation. To identify genes which were induced promoter methylation by HPV type 16, two techniques were used. First, Chromatin immunoprecipitation with DNA sequencing (ChIP-Seq) analysis was done by transfecting E7 recombinant plasmid into C33A cervical cancer cell line. After that, DNA fragments which can interact with E7 protein were precipitated and performed sequencing. Here, 3 genes consisting of FAM189A1, ASAH2B, and RAPGEF4 were explored. Another technique was bioinformatics used for selecting genes in human genome database contain the same cis elememt as CCNA1 that is the binding site of transcription factor AP2 and YY1. The result showed 9 genes that could interact with AP2 and YY1 which were NOP56, MAG, FUS, EIF2S2, RPL7, RPL10, NINJ1, LGALS1 and CLDN5 gene. Here, FAM189A1 and NOP56 gene were selected for validation. Reverse transcription polymerase chain reaction was done in E7 and empty vector in transfected C33A and HEK293 cell line. The result show that the expression of FAM189A1 and NOP56 gene was decreased in E7 transfected cell line. Moreover, methylation specific PCR were tested in HEK293 cell line to prove methylation of genes and the result showed that the methylation of FAM189A1 and NOP56 gene was increased in E7 transfected cell line. ChIP–PCR was done for proving the binding of E7, AP2 and YY1 at the promoter of candidate genes. Both FAM189A1 and NOP56 gene were interacted with E7, AP2 and YY1. Taken together, it was confirmed that the complex of E7, AP2 and YY1 could induce FAM189A1 and NOP56 promoter methylation via interacted with gene promoters and suppressed genes expression leading to decrease the expression of FAM189A1 and NOP56 gene.

Share

COinS
 
 

To view the content in your browser, please download Adobe Reader or, alternately,
you may Download the file to your hard drive.

NOTE: The latest versions of Adobe Reader do not support viewing PDF files within Firefox on Mac OS and if you are using a modern (Intel) Mac, there is no official plugin for viewing PDF files within the browser window.