การโคลนและการแสดงออกของแฟลกเจลลินจาก Bacillus subtilis N3 ใน Escherichia coli เพื่อการยับยั้งราก่อโรคในพืช Curvularia lunata

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

Cloning and expression of flagellin from Bacillus subtilis n3 in Escherichia coli for inhibition of fungal plant pathogen Curvularia lunata

Author

จุฑากาญจน์ นามสง่า, คณะวิทยาศาสตร์

Year (A.D.)

2018

Document Type

Thesis

First Advisor

ปาหนัน เริงสำราญ

Faculty/College

Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)

Department (if any)

Department of Microbiology (fac. Science) (ภาควิชาจุลชีววิทยา (คณะวิทยาศาสตร์))

Degree Name

วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Degree Level

ปริญญาโท

Degree Discipline

จุลชีววิทยาและเทคโนโลยีจุลินทรีย์

DOI

10.58837/CHULA.THE.2018.767

Abstract

Curvularia lunata เป็นราสายใยที่พบทั่วไปในดินซึ่งก่อให้เกิดโรคในพืชเศรษฐกิจหลายชนิด และส่งผลให้เกิดความเสียหายทางด้านเศรษฐกิจเป็นอย่างมาก เกษตรกรจึงจำเป็นต้องควบคุมและกำจัดรานี้ ซึ่งแนวทางที่น่าสนใจในการยับยั้งและกำจัดรา คือ การใช้วิธีการทางชีวภาพซึ่งไม่ก่อให้เกิดอันตรายต่อสิ่งมีชีวิตและไม่ส่งผลเสียต่อสิ่งแวดล้อม งานวิจัยก่อนหน้าพบว่าสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจาก Bacillus subtilis N3 สามารถยับยั้งการเจริญของ C. lunata ได้อย่างมีประสิทธิภาพ เมื่อวิเคราะห์สารออกฤทธิ์ทางชีวภาพดังกล่าว พบว่าเป็นโปรตีนที่มีความคล้ายกับแฟลกเจลลิน เอ ซึ่งเป็นยูนิตโปรตีนที่เป็นส่วนประกอบของแฟลกเจลลาในแบคทีเรีย งานวิจัยนี้จึงมุ่งศึกษายีนที่ประมวลรหัสให้โปรตีนแฟลกเจลลินจาก B. subtilis N3 โดยให้แสดงออกใน Escherichia coli BL21 ผลการวิจัยพบว่ายีนแฟกเจลลินที่สมบูรณ์จาก B. subtilis N3 มีขนาด 990 คู่เบส ที่แปลรหัสให้โปรตีนที่มีกรดอะมิโน 330 เรซิดิว โดยมีความใกล้เคียงกับโปรตีนแฟลกเจลลิน เอ ของแบคทีเรียในกลุ่ม Bacillus สูงถึง 100% เมื่อถ่ายโอนรีคอมบิแนนท์พลาสมิดที่มียีนแฟลกเจลลินดังกล่าวเข้าสู่ E. coli BL21 แล้วชักนำให้เกิดการแสดงออกของโปรตีนด้วย IPTG พบว่าส่วนของเซลล์และส่วนของน้ำเลี้ยงเชื้อที่ปราศจากเซลล์มีการแสดงออกโปรตีนขนาด 37 kDa และ 37-40 kDa ตามลำดับ ภาวะที่เหมาะสมในการชักนำให้เกิดการแสดงออกของโปรตีน คือ IPTG ความเข้มข้นสุดท้าย 0.1 มิลลิโมลาร์ เป็นเวลา 8 ชั่วโมงในส่วนของเซลล์ และ 16 ชั่วโมงในส่วนของน้ำเลี้ยงเชื้อ เมื่อนำมาทดสอบประสิทธิภาพในการยับยั้ง C. lunata พบว่าน้ำเลี้ยงเชื้อปราศจากเซลล์สามารถยับยั้ง C. lunata ได้ 21.3 % เมื่อทำบริสุทธิ์โปรตีนพบว่าโปรตีนบริสุทธิ์มีขนาดประมาณ 41 kDa และมีความสามารถในการยับยั้ง C. lunata ได้ โดยทำให้เกิดความผิดปกติของสายใยและยับยั้งการงอกของสปอร์ เมื่อโคลนและแสดงออกโดเมน N และโดเมน C ของแฟลกเจลลินพบว่าไม่เกิดการแสดงออกโปรตีนใน E. coli BL 21 เมื่อใช้วิธีการกลายแบบสุ่มบนยีนแฟลกเจลลินด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสในภาวะที่มีความแม่นยําต่ำและเอื้อต่อความผิดพลาด พบว่าโคลนที่แสดงออกโปรตีนที่เกิดการกลายบริเวณโดเมน C โดยเกิดการเปลี่ยนแปลง A330T และ D293N นั้น สูญเสียความสามารถในการยับยั้ง C. lunata เนื่องจากกรดอะมิโนที่เกิดการเปลี่ยนแปลงไปมีสมบัติเฉพาะและโครงสร้างแตกต่างกัน ซึ่งส่งผลต่อโครงสร้างสามมิติของโปรตีน ทำให้สูญเสียความสามารถในการยับยั้งราดังกล่าว งานวิจัยนี้เป็นงานวิจัยแรกที่แสดงว่าตำแหน่งของกรดอะมิโนบริเวณโดเมน C ของโปรตีนแฟลกเจลลินที่อะดีนีนตำแหน่งที่ 330 และกรดแอสพาร์ติกที่ตำแหน่ง 293 รับผิดชอบต่อความสามารถในการยับยั้ง C. lunata

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

Curvularia lunata is a filamentous fungus that generally found in soil which causes plant diseases in several economic crops and leads to substantial economic loss. Therefor, farmers need to control and eliminate this fungus where an interesting approach to inhibit and eliminate the fungus is the use of biological control method which dose not harm to organisms and does not adversely affect the enviromment. It was found from previous study that bioactive compound from Bacillus subtilis N3 was able to effectly inhibit the growth of C. lunata. Analysis of the compound revealed that the protein was high similarity to flagellin-like A protein which is the unit protein that is a component of bacterial flagella. This study aims to study the flagellin coding gene of B. subtilis N3 by expressing in Escherichia coli BL21. The result found that the complete sequence of flagellin gene from B. subtilis N3 was 990 bp in length which translated to 330 amino acid residues that showed high homology to the flagellin A protein of bacteria in Bacillus group up to 100%. After transformed the recombinant plasmid containing flagellin gene to E. coli BL21 and induced for protein expression by IPTG, it was found that the proteins with molecular weights of 37 kDa and 37-40 kDA were expressed from cell fraction and cell-free culture medium fraction, respectively. The optimal condition for proteiin induction was 0.1 mM IPTG for 8 hours in cell fraction and 16 hours in cell-free culture medium fraction. Cell-free culture medium fraction was able to inhibit C. lunata at 21.3% inhibition. After purification, the purified flagellin protein was 41 kDa and showed ability to inhibit C. lunata by causing abnormal mycelial and inhibiting conidial germination. When the domain N and domain C of flagellin gene was cloned and expressed in E. coli BL 21, it was revealed that both proteins could not express. The random mutation by error-prone PCR showed the point mutation on domain C of flagellin gene, A330T and D293N, which caused the loss of antifungal inhibition activity. Each changed amino acid has different properties and structures affecting to the three dimension of the protein and the loss of the antifungal inhibition activity. This is the first research that demonstrates that amino acids on domain C at alanine at position 330 and aspartic acid at position 293 were responsible for the inhibition of C. lunata.

Creative Commons License

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.

Recommended Citation

นามสง่า, จุฑากาญจน์, "การโคลนและการแสดงออกของแฟลกเจลลินจาก Bacillus subtilis N3 ใน Escherichia coli เพื่อการยับยั้งราก่อโรคในพืช Curvularia lunata" (2018). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 2898.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/2898