Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Follicular responsiveness to equine chorionic gonadotropin in cat species: study in in vitro culture
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
การตอบสนองของฟอลลิเคิลต่อฮอร์โมนอีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินในสัตว์ตระกูลแมวโดยการศึกษาจากการเลี้ยงฟอลลิเคิลภายนอกร่างกาย
Year (A.D.)
2018
Document Type
Thesis
First Advisor
Kaywalee Chatdarong
Second Advisor
Nucharin Songsasen
Faculty/College
Faculty of Veterinary Science (คณะสัตวแพทยศาสตร์)
Department (if any)
Department of Obstetrics, Gynaecology & Reproduction (ภาควิชาสูติศาสตร์-เธนุเวชวิทยาและวิทยาการสืบพันธุ์)
Degree Name
Doctor of Philosophy
Degree Level
Doctoral Degree
Degree Discipline
Theriogenology
DOI
10.58837/CHULA.THE.2018.519
Abstract
Equine chorionic gonadotropin (eCG) has been commonly used to induce estrus in several felid species. However, the mechanisms by which this gonadotropin regulates cat folliculogenesis are still unclear. In this present study, we investigated 1) the in vitro responsiveness of cat ovarian follicles at different follicle developmental stages to various eCG concentration; 2) tiger antral follicle responsiveness to eCG; 3) the influence of eCG combination with insulin-like growth factor I (IGF-I) and/or stem cell factor (SCF) on cat ovarian follicles at different developmental stages. Study 1, the isolated follicles from the ovaries of 22 cats were classified into three developmental stages based on their morphology and diameter: 1) two-layered secondary follicle (SF), 100-150 μm (n = 139); 2) multi-layered SF, 150-300 μm (n = 154); and 3) early antral follicle (AF), ≥ 300-500 μm (n = 123). The follicles were then encapsulated in 0.5 % (w/v) sodium alginate and cultured for 12 days in culture medium supplemented with 0, 0.05, 0.1 or 0.5 IU/mL eCG. After being cultured for 12 days, follicle growth and gene expression of two-layered SF were not influenced by eCG at all concentrations (P > 0.05). However, the concentration of eCG at 0.05 IU/mL stimulated follicular growth and gene expressions in the multi-layered SF and early AF (P < 0.05). Correspondingly, the diameter of oocytes in the multi-layered SF and early AF treated with 0.05 IU/mL eCG was unchanged. Considering the gene expression, the level of STAR was enhanced in the early AF (P < 0.05) and tended to increase in the multi-layered SF (P = 0.08) cultured in 0.05 IU/mL eCG, whereas the expression of other genes was not affected. Therefore, the responsiveness of cat follicles to eCG is apparent from the multi-layered SF stage onward and the eCG supplementation at 0.05 IU/mL appeared to be optimal for the follicle culture in the domestic cat. Study 2, the optimal concentration of eCG supplementation from the experiment 1 was selected to investigate the responsiveness of the tiger follicle to eCG. Six frozen-thawed ovarian tissue from a tiger obtained post-mortem were evaluated. Twelve isolated antral follicles recovered were randomly allocated into two culture conditions (control and 0.05 IU/mL eCG supplementation) and cultured in an alginate hydrogel for 3 days. The follicle diameters in the control group significant decreased (P < 0.05) after 3 days of culture, while the size of those in eCG supplementation group were remained constant (P > 0.05). Follicle survival was 100% in both groups. However, the oocyte retrieval rate was significant different between the two treatments (control, 33%, n = 6; eCG, 67%, n = 6) (P < 0.05). The nuclear status of all recovered oocytes was remained in germinal vesicle phase. The present study showed that the tiger frozen-thawed antral follicles could not maintain their morphology and function without eCG supplementation in the culture medium. We concluded that eCG plays an important role on tiger antral follicle growth and the survival of the oocyte. Study 3, the influence of growth factor supplementations (IGF-I, SCF and the combination of these two factors) on cat ovarian follicles at different follicle developmental stages were examined. The follicles obtained from twelve cats, encapsulated in a fibrin-alginate hydrogel and cultured for 18 days in the culture medium contained 0.05 IU/mL eCG without growth factor supplementation (control group) or supplemented with 1 ng/mL IGF-I (IGF-I), 50 ng/mL SCF (SCF50), 100 ng/mL SCF (SCF100), 1 ng/mL IGF-I + 50 ng/mL SCF (IGF-SCF50) or 1 ng/mL IGF-I + 100 ng/mL SCF (IGF-SCF100). The growth factors supplementations had no effect to two-layered SF and multi-layered SF growth, whereas SCF100 supported the growth of early AF throughout the culture period (P<0.05). However, the oocyte growth was varied among developmental stages. In the two-layered SF, IGF-I failed to maintain oocyte size after culture for 12 days. Oocytes of multi-layered SF were sustained in their initial size until the end of the study in all growth factor treated follicles. However, the present or absence of growth factor showed no effect to the oocyte of early AF. SCF50 stimulated antral cavity formation and gene regulating follicle and oocyte growth and steroidogenesis in multi-layered SF. While IGF-SCF50 was the best supplementation to early AF because it increased FSHR, GDF9 and steroidogenic genes. Therefore, SCF influenced all stages of follicle development in cat. In conclusions, the responsiveness of cat follicles to eCG was apparent from the multi-layered SF stage onward and the eCG supplementation at 0.05 IU/mL appeared to be optimal for the in vitro follicle culture in the domestic cats. The addition of SCF to culture medium supported cat folliculogenesis from multi-layered SF to early AF stage. Furthermore, similar to the domestic cat, tiger follicles also respond to 0.05 IU/mL eCG supplementation.
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
อีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินได้ถูกใช้ในการเหนี่ยวนำการเป็นสัดในสัตว์ป่าตระกูลแมวหลากหลายสปีชีส์ อย่างไรก็ตามกลไกของโกนาโดโทรปินที่ควบคุมกระบวนการสร้างฟอลลิเคิลในแมวนี้ยังคงไม่ชัดเจน ในการทดลองนี้ ทำการประเมิน 1) การตอบสนองของฟอลลิเคิลในรังไข่แมวที่ระยะการพัฒนาของฟอลลิเคิลที่ต่างกันต่ออีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินด้วยการเลี้ยงฟอลลิเคิลภายนอกร่างกาย 2) การตอบสนองของฟอลลิเคิลเสือในระยะแอนทรัลต่ออีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปิน 3) อิทธิพลของอีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินร่วมกับอินซูลินไลค์โกรทแฟคเตอร์, สเต็มเซลล์แฟคเตอร์ และการรวมกันของอินซูลินไลค์โกรทแฟคเตอร์และสเต็มเซลล์แฟคเตอร์ต่อฟอลลิเคิลในรังไข่แมวที่ระยะการพัฒนาของฟอลลิเคิลที่ต่างกัน การทดลองที่ 1 ฟอลลิเคิลแยกเดี่ยวจากรังไขของแมว 22 ตัว แบ่งเป็น 3 ระยะการพัฒนา ตามลักษณะภายนอกและเส้นผ่านศูนย์กลางของฟอลลิเคิล: 1) ฟอลลิเคิลระยะที่สองที่มีสองชั้น ขนาด100-150 ไมโครเมตร (จำนวน 139 ฟอลลิเคิล) 2) ฟอลลิเคิลระยะที่สองที่มีหลายชั้น, 150-300 ไมโครเมตร (จำนวน 154 ฟอลลิเคิล) และ 3) แอนทรัลฟอลลิเคิลระยะเริ่มต้น ≥ 300-500 ไมโครเมตร (จำนวน 123 ฟอลลิเคิล) จากนั้นฟอลลิเคิลจะถูกห่อหุ้มใน 0.5 เปอรเซ็นต์ (น้ำหนัก/ปริมาตร) โซเดียมอัลจิเนต และเลี้ยงเป็นเวลา 12 วันในน้ำยาเลี้ยงซึ่งเสริมด้วย 0, 0.05, 0.1, 0.5 ไอยู/มิลลิลิตร อีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปิน หลังจากทำการเลี้ยงไปแล้ว 12 วัน การเติบโตของฟอลลิเคิลและการแสดงออกของยีนของฟอลลิเคิลระยะที่สองที่มีสองชั้นไม่ได้รับอิทธิพลโดยอีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินที่ทุกความเข้มข้น (P > 0.05) อย่างไรก็ตามความเข้มข้นของอีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินที่ 0.05 ไอยู/มิลลิลิตร กระตุ้นการเติบโตของฟอลลิเคิลและการแสดงออกของยีนในฟอลลิเคิลระยะที่สองที่มีหลายชั้นและแอนทรัลฟอลลิเคิลระยะเริ่มต้น (P < 0.05) ความคล้ายคลึงกันที่พบคือเส้นผ่านศูนย์กลางของโอโอไซต์ในฟอลลิเคิลระยะที่สองที่มีหลายชั้นและแอนทรัลฟอลลิเคิลระยะเริ่มต้นที่ใส่ 0.05 ไอยู/มิลลิลิตร นั้นไม่มีการเปลี่ยนแปลง เมื่อพิจารณาจากการแสดงออกของยีน ระดับของ STAR เพิ่มขึ้นในแอนทรัลฟอลลิเคิลระยะเริ่มต้น (P < 0.05) และ มีแนวโน้มเพิ่มขึ้นในฟอลลิเคิลระยะที่สองที่มีหลายชั้น (P = 0.08) ที่เลี้ยงใน 0.05 ไอยู/มิลลิลิตร อีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปิน ในขณะที่ไม่มีผลต่อการแสดงออกของยีนอื่นๆ ดังนั้นการตอบสนองของฟอลลิเคิลแมวต่ออีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินพบได้ตั้งแต่ฟอลลิเคิลระยะที่สองที่มีหลายชั้นเป็นต้นไป และอีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินที่ 0.05 ไอยู/มิลลิลิตรนั้นเหมาะสมสำหรับการเลี้ยงฟอลลิเคิลในแมวบ้าน การทดลองที่ 2 ความเข้มข้นของอีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินที่เหมาะสมจากการทดลองที่ 1 ถูกเลือกมาเพื่อตรวจสอบการตอบสนองของฟอลลิเคิลเสือต่ออีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปิน เนื้อเยื่อรังไข่ที่ได้จากการแช่แข็งและทำละลาย 6 ชิ้นที่ได้มาภายหลังการตายของเสือหนึ่งตัวถูกนำมาประเมิน ฟอลลิเคิลแยกเดี่ยว 12 ฟอลลิเคิล ถูกแบ่งอย่างสุ่มเป็น 2 สภาวะการเลี้ยง (กลุ่มควบคุมและ 0.05 ไอยู/มิลลิลิตร อีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปิน) และเลี้ยงในอัลจิเนต ไฮโดรเจล 3 วัน เส้นผ่านศูนย์กลางของฟอลลิเคิลในกลุ่มควบคุมลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.05) หลังจากเลี้ยงไป 3 วัน ในขณะที่เส้นผ่านศูนย์กลางของฟอลลิเคิลในกลุ่มที่เสริมอีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินยังคงมีขนาดเหมือนตอนเริ่มต้น (P > 0.05) การรอดชีวิตของฟอลลิเคิลคือ 100% ในทั้งสองกลุ่ม อย่างไรก็ตามโอโอไซต์ที่เก็บได้ในระหว่างกลุ่มควบคุมและกลุ่มเสริมอีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินนั้นแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ (33%, จำนวน 6 ฟอลลิเคิล และ 67%, จำนวน 6 ฟอลลิเคิล ตามลำดับ) (P < 0.05) สถานะของนิวเคลียสในโอโอไซต์ที่ได้มาทั้งหมดยังคงอยู่ในระยะเจอร์มินอลเวสสิเคิล การทดลองนี้แสดงให้เห็นว่าแอนทรัลฟอลลิเคิลที่ได้จากเนื้อเยื่อที่แช่แข็งและทำละลายของเสือไม่สามารถรักษาลักษณะภายนอกและการทำงานของฟอลลิเคิลได้ หากขาดการเสริมอีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินในน้ำยาเลี้ยง เราสรุปว่าอีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินมีบทบาทสำคัญกับการเติบโตของแอนทรัลฟอลลิเคิลและการรอดชีวิตของโอโอไซต์ การทดลองที่ 3 อิทธิพลของการเสริมโกรทแฟคเตอร์ (อินซูลินไลค์โกรทแฟคเตอร์, สเต็มเซลล์แฟคเตอร์และการรวมกันของแฟคเตอร์ทั้งสอง) ต่อฟอลลิเคิลในรังไข่แมวที่ระยะการพัฒนาของฟอลลิเคิลที่ต่างกันได้ถูกตรวจสอบ ฟอลลิเคิลได้รับจากแมว 12 ตัว ถูกห่อหุ้มในไฟบรินอัลจิเนต และเลี้ยงเป็นเวลา 18 วัน ในน้ำยาเลี้ยงซึ่งมี 0.05 ไอยู/มิลลิลิตร อีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปิน ที่ไม่มีการเสริมโกรทแฟคเตอร์ (กลุ่มควบคุม) หรือ เสริมด้วย 1 นาโนกรัม/มิลลิลิตร อินซูลินไลค์โกรทแฟคเตอร์ (IGF-I), 50 นาโนกรัม/มิลลิลิตร สเต็มเซลล์แฟคเตอร์ (SCF50), 100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร สเต็มเซลล์แฟคเตอร์ (SCF100), 1 นาโนกรัม/มิลลิลิตร อินซูลินไลค์โกรทแฟคเตอร์ กับ 50 นาโนกรัม/มิลลิลิตร สเต็มเซลล์แฟคเตอร์ (IGF-SCF50) หรือ 1 นาโนกรัม/มิลลิลิตร อินซูลินไลค์โกรทแฟคเตอร์ กับ 100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร สเต็มเซลล์แฟคเตอร์ (IGF-SCF100) การเสริมโกรทแฟคเตอร์ไม่มีผลต่อการเติบโตของฟอลลิเคิลระยะที่สองที่มีสองชั้นและฟอลลิเคิลระยะที่สองที่มีหลายชั้น ในขณะที่ SCF100 ส่งเสริมการเติบโตของแอนทรัลฟอลลิเคิลระยะเริ่มต้นตลอดระยะเวลาการศึกษา (P<0.05) อย่างไรก็ตามการเติบโตของโอโอไซต์แตกต่างกันไปตามระยะการพัฒนาของฟอลลิเคิล ในฟอลลิเคิลระยะที่สองที่มีสองชั้นนั้นอินซูลินไลค์โกรทแฟคเตอร์ไม่สามารถรักษาขนาดของโอโอไซต์ภายหลังการเลี้ยง 12 วัน ในทางกลับกันโอโอไซต์ของฟอลลิเคิลระยะที่สองที่มีหลายชั้นนั้นรักษาขนาดของโอโอไซต์ได้ในทุกกลุ่มที่ใส่โกรทแฟคเตอร์จนกระทั่งจบการทดลอง อย่างไรก็ตามการมีหรือไม่มีโกรทแฟคเตอร์ต่างไม่เป็นผลต่อโอโอไซต์ของแอนทรัลฟอลลิเคิลระยะเริ่มต้น SCF50กระตุ้นการสร้างช่องว่างในแอนทรัลฟอลลิเคิลและยีนที่ควบคุมการเติบโตของฟอลลิเคิลและโอโอไซต์และการสร้างสเตียรอยด์ฮอร์โมนในฟอลลิเคิลระยะที่สองที่มีหลายชั้น ในขณะที่ IGF-SCF50 ดีที่สุดในการเสริมให้กับแอนทรัลฟอลลิเคิลในระยะเริ่มต้นเพราะมันเพิ่มการแสดงออกของยีน FSHR, GDF9 และยีนที่เกี่ยวกับการสร้างสเตียรอยด์ฮอร์โมน ดังนั้นสเต็มเซลล์แฟคเตอร์มีอิทธิพลต่อทุกระยะการพัฒนาของฟอลลิเคิลในแมว โดยสรุป การตอบสนองของฟอลลิเคิลแมวต่ออีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินพบได้ตั้งแต่ฟอลลิเคิลระยะที่สองที่มีหลายชั้นเป็นต้นไป และการเสริมอีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปินที่ 0.05 ไอยู/มิลลิลิตร เหมาะสมต่อการเลี้ยงฟอลลิเคิลภายนอกร่างกายในแมวบ้าน การเพิ่มสเต็มเซลล์แฟคเตอร์ลงในน้ำยาเลี้ยงช่วยส่งเสริมกระบวนการสร้างฟอลลิเคิลในแมวตั้งแต่ฟอลลิเคิลระยะที่สองที่มีหลายชั้นถึงแอนทรัลฟอลลิเคิลระยะเริ่มต้น ยิ่งไปกว่านั้นฟอลลิเคิลเสือก็ตอบสนองต่อการเสริมอีไควน์คอริโอนิคโกนาโดโทรปิน 0.05 ไอยู/มิลลิลิตร เช่นเดียวกับที่พบในแมวบ้าน
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
Chansaenroj, Ajjima, "Follicular responsiveness to equine chorionic gonadotropin in cat species: study in in vitro culture" (2018). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 2650.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/2650