Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
การผลิต 1, 12- โดเดคคานีดิโออิกแอซิดโดยไซโตโครม P450 ลูกผสมจากจุลินทรีย์ใน pichia pastoris และ saccharomyces cerevisiae
Year (A.D.)
2018
Document Type
Thesis
First Advisor
Warawut Chulalaksananukul
Second Advisor
Gilles Truan
Faculty/College
Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)
Degree Name
Doctor of Philosophy
Degree Level
Doctoral Degree
Degree Discipline
Biotechnology
DOI
10.58837/CHULA.THE.2018.37
Abstract
1,12-Dodecanedioic acid (DDA) is a primary compound which is used as an intermediate precursor for production of valuable chemical products. Biosynthesis of 1,12-DDA by recombinant (r) microorganisms can be used as an alternative method to compensate several disadvantages from chemical synthesis. The purpose of this study was to clone a CYP52A17 from Candida tropicalis to produce cytochrome P450 which can terminally oxidize fatty acids to hydroxy-fatty acids and further to dicarboxylic acids (ω-oxidation). The wild type rCYP52A17 and its engineered L261S/L490S (leucine changed to encode for serine) form (rCYP52A17mut) were expressed in Pichia pastoris and Saccharomyces cerevisiae which coexpressing the yeast NADPH cytochrome P450 reductase in order to produce 12-hydroxydodecanoic acid (HDDA) and, potentially, 1,12-DDA from lauric acid. The P450 contents of microsomes from P. pastoris/pPICZA-CYP52A17 and P. pastoris/pPICZA-CYP52A17mut were 0.2 nmol/mg of protein. P. pastoris/pPICZA-CYP52A17 and CYP52A17mut presented a few the oxidation ability. The recombinant P. pastoris/pPICZA-CYP52A17mut accumulated the highest level of 12-HDDA (0.8 µM) within 24 h. The recombinant S. cerevisiae expressing rCYP52A17 showed higher P450 contents than the others. The P450 content of microsomes from S. cerevisiae BY(2R)/pYeDP60-CYP52A17 and S. cerevisiae BY(2R)/pYeDP60-CYP52A17mut were 0.13 and 0.28 nmol/mg of protein, where lauric acid was oxidized to provide approximately 4 and 12 µM of 12-HDDA, respectively. Moreover, biotransformation of lauric acid by S. cerevisiae BY(2R)/pYeDP60-CYP52A17mut showed the highest level of HDDA (45.8 µM) at 24 h, which was oxidized to yield 20.8 µM 1,12-DDA at 72 h. The optimal lauric concentration of biotransformation was 500 µM, while the levels of HDDA and 1,12-DDA production in bioreactor were almost similar to the shake flask cultivation. The recombinant yeast cells which initially cultured in YPGE can be able to produce the highest 1,12- DDA from coconut milk wastewater in 24 h. From this study, S. cerevisiae BY(2R)/pYeDP60-CYP52A17mut demonstrated as a promising source to produce potential 1,12-DDA and can be applied for industrial applications.
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
1,12-Dodecanedioic acid (DDA) คือกรดไดคาร์บอกซิลิกที่เป็นสารตัวกลางสำคัญในการผลิตสารเคมีที่มีมูลค่าหลายชนิด โดยทั่วไปสารนี้สามารถสังเคราะห์ได้ด้วยวิธีการทางเคมี แต่พบว่ามีข้อเสียหลายประการ ดังนั้นจึงมีความสนใจที่จะผลิตสารนี้ด้วยวิธีทางชีวภาพ โดยการใช้จุลินทรีย์ที่มีการพัฒนาสายพันธุ์โดยการเหนี่ยวนำให้เกิดการกลายด้วยเทคนิคทางพันธุศาสตร์ วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้ คือ การโคลนยีน (r) CYP52A17 จาก Candida tropicalis ที่มีความสามารถในการออกซิไดซ์กรดไขมันไปเป็นไฮดรอกซีของกรดไขมันและกรดไดคาร์บอกซิลิก ซึ่งเรียกกระบวนการนี้ว่า ω-ออกซิเดชัน โดยทำให้ยีน rCYP52A17 เกิดการกลายจากการเปลี่ยนกรดแอมิโนตัวที่ 261 และ 490 จากลิวซีนไปเป็นเซอรีน (L261S/L490S) แล้วเรียกยีนกลายนี้ว่า rCYP52A17mut จากนั้นนำยีน rCYP52A17 และ rCYP52A17mut ไปแสดงออกใน Pichia pastoris และ Saccharomyces cerevisiae เพื่อใช้ในการผลิต12-hydroxydodecanoic acid (HDDA) และ 1,12-DDA จากสารตั้งต้นชนิดกรดลอริก โดยที่ S. cerevisiae นั้นมีการแสดงออกของ NADPH cytochrome P450 reductase ร่วมด้วย พบว่ารีคอมบิแนนท์ Pichia ที่มีการแสดงออกของ rCYP52A17 และ rCYP52A17mut ภายใต้การควบคุมของโพรโมเตอร์ที่มีการแสดงออกแบบเหนี่ยวนำ (P. pastoris/pPICZA-CYP52A17 และ P. pastoris/pPICZA-CYP52A17mut) มีปริมาณ P450 เท่ากับ 0.2 นาโนโมลต่อมิลลิกรัมโปรตีน โดยทั้งสองสายพันธุ์นี้มีความสามารถในการออกซิไดซ์กรดลอริกได้เพียงเล็กน้อย นอกจากนี้ยังพบว่า P. pastoris/pPICZA-CYP52A17mut สามารถผลิต 12-HDDA ได้สูงที่สุดเท่ากับ 0.8 ไมโครโมลาร์ภายใน 24 ชั่วโมง ในขณะที่รีคอมบิแนนท์ Saccharomyces ที่มีการแสดงออกของ rCYP52A17 และ rCYP52A17mut ภายใต้การควบคุมของโพรโมเตอร์ที่มีการแสดงออกแบบเหนี่ยวนำ (S. cerevisiae BY(2R)/pYeDP60-CYP52A17 และ S. cerevisiae BY(2R)/pYeDP60-CYP52A17mut) มีปริมาณ P450 เท่ากับ 0.13 และ 0.28 นาโนโมลต่อมิลลิกรัม ตามลำดับ นอกจากนี้ S. cerevisiae BY(2R)/pYeDP60-CYP52A17 และ S. cerevisiae BY(2R)/pYeDP60-CYP52A17mut สามารถออกซิไดซ์กรดลอริกไปเป็น 12-HDDA ได้เท่ากับ 4 และ 12 ไมโครโมลาร์ตามลำดับ เมื่อนำ S. cerevisiae BY(2R)/pYeDP60-CYP52A17mut มาเลี้ยงในอาหารที่มีกรดลอริก พบว่าสามารถผลิต 12-HDDA ได้สูงที่สุดเท่ากับ 45.8 ไมโครโมลาร์ ภายใน 24 ชั่วโมง และยังสามารถออกซิไดซ์ 12-HDDA ไปเป็น 1,12-DDA ได้เท่ากับ 20.8 ไมโครโมลาร์ภายใน 72 ชั่วโมง โดยความเข้มข้นของกรดลอริกที่เหมาะสมต่อการผลิต1,12-DDA ด้วยสายพันธุ์กลายนี้คือ 500 ไมโครโมลาร์ นอกจากนี้เมื่อนำสายพันธุ์กลายนี้มาเลี้ยงในถังหมัก 5 ลิตรพบว่าปริมาณ 12-HDDA และ 1,12-DDA ที่ผลิตได้ไม่มีความแตกต่างกันจากการเลี้ยงแบบ shake flasks สุดท้ายได้นำ S. cerevisiae BY(2R)/pYeDP60-CYP52A17mut มาประยุกต์ใช้ในการผลิต 1,12-DDA จากน้ำเสียของโรงงานผลิตกะทิ พบว่ายีสต์สายพันธุ์กลายนี้สามารถเจริญในอาหาร YPGE และผลิต 1,12-DDA ได้สูงที่สุด ภายใน 24 ชั่วโมง จากการทดลองจะเห็นได้ว่า S. cerevisiae BY(2R)/pYeDP60-CYP52A17mut มีความสามารถในการเร่งปฏิกิริยาω-ออกซิเดชันได้ทั้งสองขั้นตอน จึงแสดงให้เห็นว่าสายพันธุ์กลายนี้สามารถนำมาใช้เป็นจุลินทรีย์ทางเลือกในการผลิต 1,12-DDA ในอุตสาหกรรมได้
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
Buathong, Phawadee, "Production of 1, 12- dodecanedioic acid by recombinant microbial cytochrome P450 in pichia pastoris and saccharomyces cerevisiae" (2018). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 2168.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/2168