Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

การหาค่าเหมาะสมที่สุดสำหรับการเตรียมโปรตีนไฮโดรไลเสตจากเห็ดแครง Schizophyllum commune

Year (A.D.)

2018

Document Type

Thesis

First Advisor

Aphichart Karnchanatat

Faculty/College

Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)

Degree Name

Master of Science

Degree Level

Master's Degree

Degree Discipline

Biotechnology

DOI

10.58837/CHULA.THE.2018.33

Abstract

The optimum conditions for hydrolysate production from split gill mushroom protein using the microbial protease, Alcalase were investigated. The study was conducted using central composite design and response surface methodology. Three independent factors: hydrolysis temperature (45, 50, and 55 ?C); hydrolysis time (60, 120, and 180 min); and enzyme to substrate ratio (2%, 4%, and 6% w/v) were varied, while the pH was fixed at pH 8. These three factors had a significant effect on the DH and ABTS radical-scavenging activity (p < 0.05). The optimum conditions obtained from experiments were: enzyme to substrate ratio 2%; hydrolysis time 161.4 min; and temperature 55 ?C. The coefficient of determination (R2) of total protein and the IC50 value for ABTS radical-scavenging activity were 0.972 and 0.205 ?g/mL, respectively, and the DH value was 50.882%. The hydrolysate was fractionated by molecular weight (MW) cut-off membranes (10, 5, 3, and 0.65 kDa). The < 0.65 kDa fraction had the highest radical scavenging ability (IC50 = 0.026 ? 0.004 ?g/mL). The MW < 0.65 kDa fraction was separated by reversed-phase HPLC to yield four subfractions (F1–5). The F4 subfraction showed the highest maximum ABTS radical-scavenging activity and was selected for further analysis by quadrupole-time-of-flight-electron spin induction–mass spectrometry-based. Five antioxidant peptides were identified. In addition, the MW< 0.65 kDa fraction protected against oxidation-induced DNA damage in pBR322, pKS, and pUC19 plasmids. Furthermore, the MW < 0.65 kDa fraction, exhibited cellular antioxidant activity in a human intestinal cancer cell line (HT-29), which was dependent on the peptide concentration. These results suggested that split gill mushroom protein hydrolysate is a good source of bioactive peptides and has potential as a natural antioxidant in food production and cosmetic products.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

การศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการผลิตไฮโดรไลเสตจากโปรตีนเห็ดแครงโดยใช้เอนไซม์โปรติเอสจากจุลินทรีย์ (อัลคาเลส) การศึกษาได้ดำเนินการโดยใช้การออกแบบส่วนประสมกลาง (CCD) และวิธีพื้นผิวการตอบสนอง (RSM) ถูกนำมาใช้ในการกำหนดเงื่อนไข ซึ่งมีตัวแปรที่ศึกษา 3 ตัว ได้แก่ อุณหภูมิการไฮโดรไลซิส (45, 50, 55 องศาเซลเซียส); เวลาการไฮโดรไลซิส (60, 120, 180 นาที); และอัตราส่วนของเอนไซม์ต่อสารตั้งต้น (2, 4, 6 ร้อยละโดยปริมาตรต่อมวล) ถูกเปลี่ยนแปลงในขณะที่ค่า pH คงที่ที่ pH 8.0 จากการศึกษาพบว่า ปัจจัยทั้งสามนี้มีผลต่อกิจกรรมระดับการย่อยสลาย (DH) และการกำจัดอนุมูลอิสระโดยวิธี ABTS อย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05) ซึ่งมีสภาวะที่เหมาะสมที่ได้จากการทดลองคือเวลา 161.4 นาที อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส และอัตราส่วนของเอนไซม์ต่อสารตั้งต้นร้อยละ 2 โดยปริมาตรต่อมวล ให้ค่าระดับการย่อยสลายเท่ากับร้อยละ 50.882 และมีฤทธิ์การต้านอนุมูลอิสระซึ่งจะแสดงเป็นค่าความเข้มข้นของสารที่สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ร้อยละ 50 (IC50) เท่ากับ 0.205 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร โดยมีสัมประสิทธิ์การตัดสินใจเท่ากับ 0.997 และ 0.972 ตามลำดับ จากนั้นไฮโดรไลเสตจะถูกคัดแยกโดยน้ำหนักโมเลกุล (MW) ด้วยขนาด 10, 5, 3 และ 0.65 กิโลดาลตัน (kDa) ซึ่งพบว่า น้ำหนักโมเลกุลน้อยกว่า 0.65 kDa มีความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระสูงสุด (IC50 = 0.026 ? 0.004 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร) นำมาทำให้บริสุทธิ์โดยเทคนิคโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC) ได้ 5 พีค (F1–5) โดย F4 แสดงกิจกรรมการกำจัดอนุมูลอิสระ ABTS สูงสุด และนำไปพิสูจน์เอกลักษณ์ด้วยเทคนิคแมสสเปคโตรเมตรี พบลำดับกรดอะมิโนที่ออกฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็ง 5 ลำดับ นอกจากนี้การศึกษาความสามารถการป้องกันความเสียหายของ DNA ที่เกิดจากการออกซิเดชันในพลาสมิด pBR322, pKS, และ pUC19 พบว่า MW < 0.65 kDa มีความสามารถในการป้องกันความเสียหายของ DNA และ MW < 0.65 kDa ยังแสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของเซลล์มะเร็งในเซลล์มะเร็งลำไส้มนุษย์ (HT-29) ซึ่งความสามารถในการยับยั้งขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของเปปไทด์ ถึงแม้ว่าฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระไม่สัมพันธ์กับสัดส่วนของค่าระดับการย่อยสลาย เนื่องจากโครงสร้างและน้ำหนักโมเลกุลรวมถึงลำดับของกรดอะมิโนที่เกิดขึ้น อย่างไรก็ตามผลการวิจัยชี้ให้เห็นว่า RSM ที่มีการออกแบบส่วนประสมกลางได้พิสูจน์แล้วว่าเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของพารามิเตอร์ในการหาค่าระดับการย่อยสลาย และกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระ ผลการวิจัยเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าโปรตีนไฮโดรไลเสตจากเห็ดแครงเป็นแหล่งของเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพที่ดีและมีศักยภาพในการเป็นสารต้านอนุมูลอิสระตามธรรมชาติในการผลิตอาหารและผลิตภัณฑ์เครื่องสำอาง

Included in

Biotechnology Commons

Share

COinS
 
 

To view the content in your browser, please download Adobe Reader or, alternately,
you may Download the file to your hard drive.

NOTE: The latest versions of Adobe Reader do not support viewing PDF files within Firefox on Mac OS and if you are using a modern (Intel) Mac, there is no official plugin for viewing PDF files within the browser window.