Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
ลักษณะสมบัติเชิงหน้าที่ของฮีตช็อกโปรตีนในการตอบสนองต่อความเครียดในกุ้งขาวแปซิฟิก Penaeus vannamei และอาร์ทีเมีย Artemia franciscana
Year (A.D.)
2018
Document Type
Thesis
First Advisor
Anchalee Tassanakajon
Second Advisor
Bossier, Peter
Third Advisor
Stappen, Gilbert Van
Faculty/College
Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)
Department (if any)
Department of Biochemistry (fac. Science) (ภาควิชาชีวเคมี (คณะวิทยาศาสตร์))
Degree Name
Doctor of Philosophy
Degree Level
Doctoral Degree
Degree Discipline
Biochemistry
DOI
10.58837/CHULA.THE.2018.5
Abstract
Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) caused by the bacterium Vibrio parahaemolyticus carrying toxin produced plasmid (VPAHPND), has led to severe mortalities in farmed penaeid shrimp throughout Asia. Our studies demonstrated that a chronic non-lethal heat shock (chronic-NLHS) could enhance resistance of the Pacific white shrimp Penaeus vannamei to VPAHPND infection. Shrimp exposed to chronic-NLHS (28 °C to 38 °C, 5 min for 7 days) had higher survival rate (>50%) than that of the control non-heated shrimp (20%) when they were challenged with VPAHPND. The qRT-PCR analysis revealed that the expression of heat shock proteins, LvHSP70 and LvHSP90, as well as other immune-related genes, LvproPO1 and LvCrustin1, were induced upon exposure of shrimp to chronic NLHS. Moreover, LvHSP70 and LvHSP90 gene silencing eradicated the VPAHPND resistance in the chronic-NLHS shrimp and decreased PO activity. Further investigation showed that chronic-NLHS immediately activated the production of LvHSP70 in shrimp hemocytes. Injection of 1.0 nmol recombinant LvHSP70 (rLvHSP70) of injection induced the expression of several immune-related genes (LvMyD88, LvIKKε, LvIKKβ, LvCrustin1, LvPEN2, LvPEN3, LvproPO1, LvproPO2, and LvTG1) in the shrimp immune system. Interestingly, rLvHSP70 enhanced P. vannamei resistance to VPAHPND by increasing survival rate from 20% (control group) to >75%. These results suggested that LvHSP70 plays crucial roles in bacterial defense by activating shrimp immune system. In addition, four novel HSP70 family genes designated as HSC70, HSC70-5, BIP, and HYOU1 were identified from the draft Artemia transcriptome database by sequence analysis that contained the specific conserved domain of HSP70 family gene. Expression analysis revealed that in the juvenile state, the transcript level of HSP70 and HSC70 was significantly higher in the selective breeding for induced thermotolerance population (TF12) of Artemia relative to a control population (CF12). Moreover, after a NLHS treatment of TF12 at the nauplii state, HSP70, HSC70, and HSC70-5 transcrips were significantly (P<0.05) up-regulated. In contrast, the expression of the other members of Artemia franciscan HSP70 family showed no significant (P>0.05) induction. Furthermore, SNP polymorphisms of HSP70 and HSC70 genes were investigated and the result identified a SNP at position 171 in HSC70 (C171A; N57K) located at ATP-binding domain which might be potentially associated with the increased thermotolerance. The genotype analysis result showed significant (P<0.01) difference of this SNP between CF12 and TF12. Moreover, the phenotypic analysis by yeast (Saccharomyces cerevisiae) system confirmed that yeast contained the HSC70-N57K plasmid could tolerate high temperature than yeast containing the WT-HSC70 plasmid. As the N57K genotype was more prevalent in TF12 population than that in CF12 suggesting that it can be used in selective breeding for induced thermotolerance in A. franciscana.
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
กลุ่มอาการตับและตับอ่อนตายเฉียบพลันที่เกิดจากการติดเชื้อแบคทีเรียวิบริโอพาราฮีโมไลติคัสสายพันธุ์ที่มีพลาสมิดที่สามารถสร้างท็อกซินได้เป็นสาเหตุสำคัญในการเกิดการตายจำนวนมากในฟาร์มเลี้ยงกุ้งขาวทั่วทวีปเอเชีย ในงานวิจัยนี้พบว่าการกระตุ้นกุ้งด้วยความร้อนที่ไม่ตายแบบต่อเนื่อง (จาก 28 °C ไปยัง 38 °C ครั้งละ 5 นาที ซ้ำเป็นเวลา 7 วัน) สามารถป้องกันการติดเชื้อแบคทีเรียวิบริโอพาราฮีโมไลติคัสได้ โดยมีอัตราการรอดมากกว่า 50% ในขณะกลุ่มที่ไม่ได้ถูกกระตุ้นด้วยความร้อนมีอัตราการรอดเพียง 20 % ผลการศึกษาการแสดงออกของยีนด้วยเทคนิค qRT-PCR พบว่ามีการแสดงออกที่เพิ่มมากขึ้นของยีนฮีตช็อกโปรตีน 70 และ 90 และยีนในระบบภูมิคุ้มกันได้แก่ LvproPO1 และ LvCrustin1 ในกุ้งที่กระตุ้นด้วยความร้อน และเมื่อทำการยับยั้งการแสดงออกของยีนฮีตช็อกโปรตีน 70 และ 90 พบว่าความสามารถในการทนต่อการติดเชื้อวิบริโอพาราฮีโมไลติคัสซึ่งก่อให้เกิดโรคลดน้อยลงและยังส่งผลให้แอคติวิตี้ของระบบโพรฟีนอลออกซิเดสลดลงอีกด้วย ในการศึกษาหน้าที่ของโปรตีนฮีตช็อกโปรตีน 70 ผลการทดลองพบว่าการกระตุ้นกุ้งด้วยความร้อน สามารถกระตุ้นการผลิตโปรตีนฮีตช็อกโปรตีน 70 ในเม็ดเลือดกุ้งเพิ่มมากขึ้นเมื่อเทียบกับกลุ่มที่ไม่ถูกกระตุ้นด้วยความร้อน เมื่อฉีดโปรตีนรีคอมบิแนนท์ 70 (1 nmol) เข้าสู่ตัวกุ้งปริมาณ พบว่ายีนในระบบภูมิคุ้มกันของกุ้งหลายตัวได้แก่ LvMyD88 LvIKKε LvIKKβ LvCrustin1 LvPEN2 LvPEN3 LvproPO1 LvproPO2 และ LvTG1 มีการแสดงออกเพิ่มมากขึ้นและนอกจากนี้ยังเพิ่มการต้านทานของกุ้งต่อการติดเชื้อแบคทีเรียวิบริโอพาราฮีโมไลติคัสได้ โดยกุ้งมีอัตราการรอดเมื่อติดเชื้อเพิ่มจาก 20% ในกลุ่มควบคุมเป็นมากกว่า 75% ในกลุ่มที่ฉีดด้วยรีคอมบิแนนท์โปรตีน แสดงให้เห็นว่าฮีตช็อกโปรตีน 70 ทำหน้าที่สำคัญในการตอบสนองต่อการติดเชื้อแบคทีเรียโดยการกระตุ้นการทำงานในระบบภูมิคุ้มกันของกุ้ง นอกจากนี้ยังได้ใช้ข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์จากฐานข้อมูลจีโนมของ Artemia franciscana ในการศึกษาและระบุ ลำดับนิวคลีโอไทด์ ลำดับกรดอะมิโน และ แผนภูมิความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมของยีนในกลุ่มฮีตช็อกโปรตีน 70 พบว่าจากฐานข้อมูลฯ สามารถระบุยีนที่แตกต่างกันของยีนในกลุ่มฮีตช็อกโปรตีน 70 ได้จำนวน 4 ยีน ซึ่งประกอบไปด้วย HSC70 HSC70-5 BIP และ HYOU1 และเมื่อศึกษาการแสดงออกของยีนในกลุ่มฮีตช็อกโปรตีน 70 ในตัวอย่างอาร์ทีเมียที่ถูกคัดเลือกสายพันธุ์ให้สามารถทนต่อความร้อนได้ในระยะวัยรุ่น พบว่าระดับการแสดงออกของยีน HSP70 และ HSC70 มีการแสดงออกที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในอาร์ทีเมียกลุ่มที่ถูกคัดเลือกสายพันธุ์ฯ เทียบกับกลุ่มที่เลี้ยงในสภาวะปกติ ยิ่งไปกว่านั้นเมื่อกระตุ้นอาร์ทีเมียระยะนอเพลียสด้วยความร้อนแบบไม่ตาย พบว่ายีน HSP70 HSC70 และ HSC70-5 มีการแสดงออกเพิ่มมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่ออาร์ทีเมียที่ถูกคัดเลือกสายพันธุ์ฯ และถูกกระตุ้นด้วยความร้อนแบบไม่ตายเทียบกับอาร์ทีเมียที่ถูกคัดเลือกสายพันธุ์แต่ไม่ถูกกระตุ้นด้วยความร้อนแบบไม่ตาย ในทางตรงกันข้ามยีน BIP HYOU1 และ HSPA4 ไม่พบการแสดงออกเพิ่มมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ มากไปกว่านี้ได้ทำการค้นหาความแตกต่างเพียงลำดับนิวคลีโอไทด์เดียวในยีน HSP70 และ HSC70 พบว่ายีน HSC70 มีความแตกต่างเพียงลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ตำแหน่ง 171 (C171A; N57K) ซึ่งเป็นตำแหน่งบนบริเวณโดเมน ATP-binding ซึ่งน่าจะมีความเป็นไปได้ที่จะเกี่ยวข้องกับการเพิ่มความต้านทานต่อความร้อน และจากการศึกษาลักษณะฟีโนไทป์ในยีสต์ Saccharomyces cerevisiae ยืนยันได้ว่ายีสต์ที่มีพลาสมิด HSC70-N57K สามารถทนต่ออุณหภูมิสูงได้มากกว่ายีสต์ที่มีพลาสมิด WT-HSC70 และสืบเนื่องจากการที่ลักษณะฟีโนไทป์ N57K สามารถพบได้ในอาร์ทีเมียที่ถูกคัดเลือกสายพันธุ์ให้ทนความร้อน มากกว่ากลุ่มที่ไม่ถูกคัดเลือกสายพันธุ์ ทำให้ฟีโนไทป์ดังกล่าวสามารถใช้ในการคัดเลือกสายพันธุ์อาร์ทีเมียให้ทนต่อความร้อนได้
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
Junprung, Wisarut, "Functional characterization of heat shock proteins during stress response in pacific white shrimp Penaeus vannamei and brine shrimp Artemia franciscana" (2018). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 2136.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/2136