The expressions of mhc class i and class ii in biopsy tissues by immunohistochemistry and the effect of interferon-gamma (ifn-γ) on in vitro established canine cutaneous mast cell tumors

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

การแสดงออกของกลุ่มจีน MHC I และ MHC II ในเนื้อเยื่อด้วยวิธีอิมมูนโนฮิสโตเคมีและผลของอินเตอร์เฟอรอนแกมมาในเซลล์เพาะเลี้ยงของมะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์ในสุนัข

Author

Sudchaya Bhanpattanakul, Faculty of Veterinary Science

Year (A.D.)

2023

Document Type

Thesis

First Advisor

Theerayuth Kaewamatawong

Second Advisor

Theerawat Tharasanit

Faculty/College

Faculty of Veterinary Science (คณะสัตวแพทยศาสตร์)

Department (if any)

Department of Pathology (fac. Veterinary Science) (ภาควิชาพยาธิวิทยา (คณะสัตวแพทยศาสตร์))

Degree Name

Doctor of Philosophy

Degree Level

Doctoral Degree

Degree Discipline

Veterinary Pathobiology

DOI

10.58837/CHULA.THE.2023.1514

Abstract

Canine mast cell tumors (MCT), common skin tumors in dogs, present difficulties in treatment, emphasizing the need for effective therapeutic protocols. The cancer-immunity cycle's complex interactions between cancer and the immune system play a crucial role in tumor growth. Tumors often evade immune response by downregulating MHC expression, hindering T-cell recognition. Cancer immunotherapy is a promising approach that utilizes the patient's immune system for combating cancer. Interferon-gamma (IFN-γ), a potent immune substance, plays a crucial role in enhancing MHC expression and immune functionality, crucial for T-cell recognition and cancer cell elimination. Limited research exists on MHC expression, tumor immune response, and IFN-γ impact in canine cutaneous MCT. To fulfill this research gap, we conducted three in vitro studies from canine MCT samples. Study 1 assessed MHC expression and its correlation with CD4+ and CD8+ T cells in canine cutaneous MCT tissues using immunohistochemistry (IHC). Results showed significantly higher MHC I and CD8 T lymphocyte levels in low grade MCT compared to high grade MCT. Although not statistically significant, low-grade MCT exhibited higher MHC II and CD4+ T lymphocytes. Positive correlations between MHC I and CD8 T lymphocytes, and between MHC II and CD4+ T lymphocytes were observed, suggesting a potential link in low-grade MCT. These findings support the notion that increased MHC expression in cancers correlates with elevated tumor-infiltrating lymphocytes, contributing to tumor control and indicating a more favorable prognosis. This study highlights the potential importance of MHC expression in canine cutaneous MCT for prognosis and therapy. Study 2 aimed to establish and characterize a novel in-house canine cutaneous MCT cell line, named C18, and compare it with three reference cell lines (CMMC, VIMC, CoMS). C18, derived from high grade cutaneous MCT, exhibited consistent gene expression, including c-kit, tryptase, FcεRIα, and FcεRIβ, maintained over 140 passages. In contrast to reference lines, The C18 showed the longest doubling time and the smallest spheroid size, indicating lower metabolic activity and growth. The C18 exhibited c-kit internal tandem duplication (ITD) in exon 11 and nine single nucleotide polymorphisms (SNPs) in five genes (c-kit, HYAL4, SEL1L, SPAM1, and TRAF3). In terms of tumor sensitivity, C18 showed more susceptibility to immune cell-mediated cytotoxicity compared to the other reference cell lines, suggesting its potential in cancer immunotherapy research. Study 3 optimized in vitro conditions to enhance MHC expression and assess cellular responses in canine MCT cell lines following IFN-γ treatment within an MCT-PBMCs co-culture system. All four lines, including the C18 cell line and three references, showed increased MHC expression with 10 IU/mL IFN-γ for 48 hours. IFN-γ induced apoptosis in MCT cell lines during co-culture with PBMCs, particularly at a high Target: Effector (T: E) ratio of 1:100, suggesting its anti-tumor potential for canine MCT. Variations in MHC expression and apoptosis rates were observed among cell lines, with cutaneous-origin lines exhibiting higher MHC expression and greater apoptosis propensity. These findings imply potential biological variations and treatment responses. The data highlight IFN-γ’s potential as an anti-cancer agent for canine MCTs, with co-culturing indicating increased apoptosis compared to untreated cells. In conclusion, our study highlights tumor heterogeneity in canine cutaneous MCT, noting higher MHC expression and increased lymphocyte infiltration in low grade cases. The established C18 cell line holds promise as an in vitro model for evaluating IFN-γ’s impact on MHC expression and studying various aspects of canine MCT. Additionally, our in vitro findings highlight variations among canine MCT cell lines in tumor characteristics and cellular responses to IFN-γ in an MCT-PBMCs co-culture system.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

มะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์ (mast cell tumor; MCT) ในสุนัข เป็นมะเร็งผิวหนังที่พบได้บ่อยในสุนัขทั่วโลก และมักพบว่าผลการรักษาและการพยากรณ์โรคที่ไม่พึงประสงค์ ดังนั้นวิธีการรักษาใหม่ที่มีประสิทธิภาพจึงมีความจำเป็นอย่างยิ่ง โดยวงจรการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันต่อมะเร็ง (cancer-immunity cycle) นี้ เป็นกระบวนการที่มีบทบาทสำคัญต่อการเจริญเติบโตของมะเร็ง กลไกที่สําคัญที่เซลล์มะเร็งใช้เพื่อหลบเลี่ยงระบบภูมิคุ้มกันคือการลดการแสดงออกของกลุ่มจีน MHC ซึ่งเป็นอุปสรรคต่อการกระบวนการรับรู้และกําจัดเซลล์มะเร็งของทีเซลล์ (T-cell) ในการรักษาด้วยภูมิคุ้มกันบําบัดโรคมะเร็ง เป็นวิธีการรักษาที่มีแนวทางในการใช้ระบบภูมิคุ้มกันของผู้ป่วยในการต่อสู้กับโรคมะเร็ง โดยอินเตอร์เฟอรอนแกมมา (Interferon-gamma) เป็นหนึ่งในสารที่เกี่ยวข้องกับประสิทธิภาพการทำงานของระบบภูมิคุ้มกัน เนื่องจากมีความสามารถในการเพิ่มการแสดงออกของ MHC และการทำงานของระบบภูมิคุ้มกัน โดยเฉพาะกระบวนการการรับรู้และกำจัดเซลล์มะเร็งของทีเซลล์ อย่างไรก็ตามงานวิจัยที่เกี่ยวข้องกับการแสดงออกของ MHC การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อมะเร็ง และผลของอินเตอร์เฟอรอนแกมมาต่อมะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์ในสุนัขยังคงมีจํากัด ดังนั้นเพื่อเติมเต็มช่องว่างของงานวิจัยทางด้านนี้ ทางผู้วิจัยจึงได้ดำเนินการทำการทดลองจากตัวอย่างของมะเร็งชนิดมาสท์เซลล์ของสุนัขภายในห้องปฏิบัติการ โดยแบ่งการศึกษาออกเป็น 3 การศึกษา ดังนี้ การศึกษาที่ 1 เพื่อตรวจสอบการแสดงออกของ MHC และความสัมพันธ์กับทีเซลล์ซีดีสี่ (CD4+ T cell) และทีเซลล์ซีดีแปด (CD8+ T cell) ในตัวอย่างเนื้อเยื่อมะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์ของสุนัขด้วยวิธีอิมมูนโนฮิสโตเคมี ผลการวิจัยพบว่าในมะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์เกรดต่ำ (low grade) มีระดับการแสดงออกของ MHC I และ CD8+ T cell สูงกว่าในมะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์เกรดสูง (high grade) อย่างมีนัยสําคัญ และในมะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์เกรดต่ำยังมีแนวโน้มในการแสดงออกของ MHC II และ CD4+ T cell สูงกว่าในมะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์เกรดสูง นอกจากนี้ผลการวิจัยยังพบความสัมพันธ์เชิงบวกของระดับการแสดงออกระหว่าง MHC I และ CD8+ T cell และระหว่าง MHC II และ CD4+ T cell ซึ่งชี้ให้เห็นถึงความเชื่อมโยงที่อาจเกิดขึ้นในมะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์เกรดต่ำในสุนัข โดยผลการวิจัยนี้สนับสนุนแนวคิดที่ว่าการแสดงออกของ MHC ที่สูงขึ้นในมะเร็งชนิดต่าง ๆ มีความสัมพันธ์กับจำนวนเซลล์เม็ดเลือดขาวลิมโฟไซต์ที่แทรกซึมเข้าไปในมะเร็ง (tumor-infiltrating lymphocytes; TILs) ที่เพิ่มขึ้น ซึ่งเอื้อต่อการควบคุมและกําจัดมะเร็ง บ่งบอกถึงการพยากรณ์โรคที่ดีขึ้น การศึกษานี้แสดงถึงบทบาทที่สำคัญของการแสดงออกของ MHC ในมะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์ของสุนัขและความเป็นไปได้ในการนำไปใช้ในการพยากรณ์โรคและการรักษา การศึกษาที่ 2 มีวัตถุประสงค์เพื่อสร้างเซลล์ไลน์ใหม่จากสุนัขที่เป็นมะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์ โดยเซลล์ไลน์ใหม่นั้นชื่อว่า C18 และทำการเปรียบเทียบกับเซลล์ไลน์อ้างอิง 3 เซลล์ไลน์ (CMMC, VIMC และ CoMS) ผลการวิจัยพบว่าสามารถสร้างเซลล์ไลน์ใหม่ได้จากสุนัขที่เป็นมะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์เกรดสูง โดยเซลล์ไลน์ C18 นี้มีการแสดงออกของจีน c-kit, tryptase, FcεRIα และ FcεRIβ และสามารถเพาะเลี้ยงได้มากกว่า 140 passages โดยเซลล์ไลน์ C18 มีระยะเวลาที่ใช้ในการเพิ่มจำนวนเป็นสองเท่ายาวนานที่สุดและมีขนาดสเฟียรอยด์เล็กที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ไลน์อ้างอิง ซึ่งบ่งชี้ว่าเซลล์ไลน์ C18 มีกระบวนการเมแทบอลิกและการเจริญเติบโตที่ต่ำกว่าเซลล์ไลน์อ้างอิง นอกจากนี้เซลล์ไลน์ C18 ยังพบการกลายพันธุ์ของจีน c-kit แบบ Internal Tandem Duplication (ITD) ใน exon 11 และยังพบ 9 ซิงเกิลนิวคลีโอไทด์โพลีมอร์ฟิซึมจากจีนจำนวน 5 จีน ได้แก่ c-kit, HYAL4, SEL1L, SPAM1 และ TRAF3 สำหรับการเปรียบเทียบความไวของเซลล์ไลน์ต่อความเป็นพิษต่อเซลล์เนื่องจากเซลล์ภูมิคุ้มกัน พบว่าเซลล์ไลน์ C18 มีความไวต่อความเป็นพิษต่อเซลล์เนื่องจากเซลล์ภูมิคุ้มกันมากกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ไลน์อ้างอิงอื่น ๆ ซึ่งชี้ให้เห็นถึงศักยภาพในการใช้เพื่องานวิจัยเกี่ยวกับภูมิคุ้มกันบําบัดมะเร็งได้ การศึกษาที่ 3 มีวัตถุประสงค์เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการเพิ่มการแสดงออกของ MHC และตรวจสอบการตอบสนองของเซลล์มะเร็งชนิดมาสท์เซลล์ของสุนัขหลังการกระตุ้นด้วยอินเตอร์เฟอรอนแกมมาในระบบการเพาะเลี้ยงร่วมกันระหว่างเซลล์มะเร็งชนิดมาสท์เซลล์และเซลล์โมโนนิวเคลียร์ โดยทำการศึกษาทั้งในเซลล์ไลน์ C18 และเซลล์ไลน์อ้างอิง 3 เซลล์ไลน์ ผลการวิจัยพบว่าการกระตุ้นเซลล์ไลน์ทั้ง 4 เซลล์ไลน์ด้วยอินเตอร์เฟอรอนแกมมา 10 IU/mL เป็นเวลา 48 ชั่วโมง สามารถเพิ่มการแสดงออกของ MHC ได้อย่างเหมาะสมในทุกเซลล์ไลน์ และด้วยการกระตุ้นนี้ทำให้เกิดการตายของเซลล์แบบอะพอพโทติกขึ้นในระหว่างการเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์โมโนนิวเคลียร์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่อัตราส่วน เซลล์เป้าหมาย: เซลล์เอฟเฟกเตอร์ (Target: Effector) ที่ 1:100 ซึ่งอาจบ่งชี้ถึงศักยภาพในการใช้อินเตอร์เฟอรอนแกมมาเป็นสารต้านมะเร็งสำหรับสุนัขที่เป็นมะเร็งชนิดมาสท์เซลล์ได้ นอกจากนี้ยังพบความแปรผันของระดับการแสดงออกของ MHC และอัตราการตายของเซลล์ไลน์ที่แตกต่างกัน โดยเซลล์ไลน์ที่มีต้นกำเนิดจากผิวหนังมีการแสดงออกของ MHC ที่สูงขึ้นและมีแนวโน้มที่จะเกิดการตายของเซลล์มากกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ไลน์ที่มีต้นกำเนิดจากอวัยวะภายในและเยื่อเมือกช่องปาก จากผลการวิจัยบ่งชี้ถึงความผันแปรทางชีวภาพที่อาจเกิดขึ้นและการตอบสนองต่อการรักษา ผลการศึกษาของกลุ่มผู้วิจัยยังได้นําเสนอประสิทธิภาพของอินเตอร์เฟอรอนแกมมาในการใช้เป็นสารต้านมะเร็งสำหรับสุนัขที่เป็นมะเร็งชนิดมาสท์เซลล์ โดยทำการเพาะเลี้ยงเซลล์ไลน์มะเร็งชนิดมาสท์เซลล์ของสุนัขที่ผ่านการกระตุ้นด้วยอินเตอร์เฟอรอนแกมมาร่วมกับเซลล์โมโนนิวเคลียร์ พบว่ามีแนวโน้มการตายของเซลล์มะเร็งที่เพิ่มขึ้นเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์มะเร็งที่ไม่ได้รับการกระตุ้น โดยสรุป งานวิจัยนี้แสดงให้เห็นถึงความแตกต่างของมะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์ในสุนัข โดยมะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์เกรดต่ำมีระดับการแสดงออกของ MHC และมีการแทรกของเซลล์เม็ดเลือดขาวลิมโฟไซต์ที่สูงกว่ามะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์เกรดสูง นอกจากนี้ เซลล์ไลน์ C18 ที่ได้จากการเพาะเลี้ยงในการศึกษาครั้งนี้ยังมีประสิทธิภาพในการใช้เป็นต้นแบบการทดลองภายในห้องปฏิบัติการ เพื่อใช้ประเมินผลของอินเตอร์เฟอรอนแกมมาต่อการแสดงออกของ MHC และยังสามารถใช้สำหรับการศึกษาในแง่มุมที่หลากหลายของมะเร็งผิวหนังชนิดมาสท์เซลล์ในสุนัขได้ต่อไป นอกจากนี้ผลการศึกษาเมื่อทำการทดลองเปรียบเทียบกับเซลล์ไลน์อ้างอิงชนิดต่างๆ พบว่ามีความแตกต่างกัน ในแง่ของลักษณะและคุณสมบัติของเซลล์มะเร็ง รวมทั้งการตอบสนองของเซลล์ต่อการกระตุ้นด้วยอินเตอร์เฟอรอนแกมมาในระบบการเพาะเลี้ยงร่วมระหว่างเซลล์มะเร็งชนิดมาสท์เซลล์และเซลล์โมโนนิวเคลียร์

Creative Commons License

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.

Recommended Citation

Bhanpattanakul, Sudchaya, "The expressions of mhc class i and class ii in biopsy tissues by immunohistochemistry and the effect of interferon-gamma (ifn-γ) on in vitro established canine cutaneous mast cell tumors" (2023). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 75276.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/75276