Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

STRUCTURE AND FUNCTION ANALYSIS OF crustinPm1 AND crustinPm7 FROM BLACK TIGER SHRIMP Penaeus monodon

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

การวิเคราะห์โครงสร้างและหน้าที่ของ crustinPm1 และ crustinPm7 จากกุ้งกุลาดำPenaeus monodon

Year (A.D.)

2013

Document Type

Thesis

First Advisor

Anchalee Tassanakajon

Second Advisor

Kuakarun Krosong

Faculty/College

Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)

Degree Name

Master of Science

Degree Level

Master's Degree

Degree Discipline

Biotechnology

DOI

10.58837/CHULA.THE.2013.888

Abstract

Antimicrobial peptides (AMPs) are considered to play an important role in humoral defense against pathogen infection. CrustinPm1 and crustinPm7 are two of most abundant crustin identified from the hemocytes of the black tiger shrimp, Penaeus monodon. This research aims to study (1) activities and binding properties of the recombinant crustinPm1 (rcrustinPm1) and recombinant crustinPm7 (rcrustinPm7), (2) the secondary structure of both crustins, (3) crystallization of the rcrustinPm1, and (4) the regulation of crustinPm1 and crustinPm7 gene expressions. In this study, crustinPm1 and crustinPm7 were overexpressed in Pichia pastoris. Antimicrobial assays demonstrated that rcrustinPm1 was active against Gram-positive bacteria only but rcrustinPm7 inhibited both Gram-positive and Gram-negative bacteria. The rcrustinPm1 and rcrustinPm7 showed no proteinase inhibitory activity against the commercial proteinases and proteinase from Bacillus subtilis. Study of lipid-protein interaction showed that both crustins could specifically bind phosphatidic acid (PA). Enzyme-linked immunosorbent assay suggested that crustins bind to PA with positive cooperativity of Hill slope (H) > 2. This indicates that at least two molecules of crustins interact with one PA molecule. In addition, circular dichroism spectroscopy was used to determine secondary structure of crustinPms. CrustinPm1 contained 40.81% of alpha-helix and 22.34% of beta-sheet, whereas crustinPm7 contained 32.86% of alpha-helix and 27.53% of beta-sheet. Crystallization of rcrustinPm1 was performed and crystals were obtained in some crystallization conditions. However, these crystals gave no diffraction. Therefore, crystallization conditions will be optimized for further crystal growth. Regulatory pathways of crustinPm1 and crustinPm7 were investigated by PmRelish and PmMyD88 knockdown. It is likely that crustinPm1 was mediated through Toll signaling pathway, while crustinPm7 was related with both Toll and Imd pathways.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

เปปไทด์ต้านจุลชีพมีบทบาทสำคัญในระบบภูมิคุ้มกันโดยสารน้ำ ซึ่งมีฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลชีพ ครัสตินไอโซฟอร์ม 1 (crustinPm1) และครัสตินไอโซฟอร์ม 7 (crustinPm7) เป็นสองไอโซฟอร์มซึ่งพบมากในเม็ดเลือดของกุ้งกุลาดำ งานวิจัยนี้สนใจศึกษา (1) ฤทธิ์การยับยั้งการเจริญของแบคทีเรีย และสมบัติการจับของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ crustinPm1 และ crustinPm7 (2) โครงสร้างทุติยภูมิของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ครัสตินทั้งสองไอโซฟอร์ม (3) การตกผลึกของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ crustinPm1 และ (4) การควบคุมการแสดงออกของยีน crustinPm1 และ crustinPm7 จากการศึกษาโปรตีนรีคอมบิแนนท์ crustinPm1 และ crustinPm7 มีการแสดงออกอย่างมากในยีสต์ Pichia pastoris และเมื่อทดสอบฤทธิ์การยับยั้งเชื้อแบคทีเรีย พบว่า crustinPm1 มีฤทธิ์ยับยั้งแบคทีเรียแกรมบวกเท่านั้น ในขณะที่ crustinPm7 สามารถยับยั้งได้ทั้งแบคทีเรียแกรมบวก และแบคทีเรียแกรมลบ อีกทั้งศึกษาฤทธิ์การยับยั้งการทำงานของเอนไซม์โปรติเนส พบว่า โปรตีนรีคอมบิแนนท์ crustinPm1 และ crustinPm7 ไม่มีแอคทิวิตีในการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์โปรติเนสทางการค้า และเอนไซม์โปรติเนส จาก Bacillus subtilis จากการศึกษาการจับกันระหว่างลิพิดและโปรตีน แสดงให้เห็นว่า ครัสตินทั้งสองไอโซฟอร์มสามารถจับได้อย่างจำเพาะกับกรดฟอสฟาทิดิก (Phosphatidic acid, PA) และจากผลของ Enzyme-linked immunosorbent (ELISA) assay พบว่า ครัสตินทั้งสองไอโซฟอร์มสามารถจับกับกรดฟอสฟาทิดิก แบบ Positive cooperative โดยมีค่า Hill slope (H) มากกว่า 2 ชี้ให้เห็นว่า ครัสตินอย่างน้อย 2 โมเลกุล สามารถจับกับกรดฟอสฟาทิดิก 1 โมเลกุล จากการศึกษาโครงสร้างทุติยภูมิของครัสตินทั้งสองไอโซฟอร์มโดยวิธีเซอร์คิวลาร์ไดโครอิซึม (Circular Dichroism Spectroscopy) แสดงให้เห็นว่า โปรตีนรีคอมบิแนนท์ crustinPm1 มีองค์ประกอบของ alpha-helix 40.81% และ beta-sheet 22.34% ส่วนโปรตีนรีคอมบิแนนท์ crustinPm7 มีองค์ประกอบของ alpha-helix 32.86% และ beta-sheet 27.53% จากการทดลองตกผลึกโปรตีนรีคอมบิแนนท์ crustinPm1 พบว่า ได้ผลึกของโปรตีนในหลายสภาวะ อย่างไรก็ตาม พบว่าผลึกที่ได้นั้นไม่ให้การเลี้ยวเบนของรังสีเอ็กซ์ จึงต้องปรับปรุงสภาวะเพื่อให้เหมาะสมสำหรับการเติบโตของผลึก นอกจากนี้ ได้ทำการทดลองลดการแสดงออกของ PmRelish และ PmMyD88 ถูกทำให้ไม่มีการแสดงออก เพื่อศึกษาวิถีการควบคุมการแสดงออกของ crustinPm1 และ crustinPm7 ซึ่งพบว่า crustinPm1 ถูกควบคุมผ่านวิถี Toll ในขณะที่ crustinPm7 ถูกควบคุมผ่านทั้งวิถี Toll และ Imd

Link to Full Text

Share

COinS