Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

Chitinase from thermotolerant bacteria : enzyme characterization and gene cloning

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

ไคทิเนสจากแบคทีเรียทนร้อน : ลักษณะสมบัติและการโคลนยีน

Year (A.D.)

2001

Document Type

Thesis

First Advisor

Rath Pichyangkura

Faculty/College

Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)

Degree Name

Master of Science

Degree Level

Master's Degree

Degree Discipline

Biochemistry

DOI

10.58837/CHULA.THE.2001.950

Abstract

Thermotolerant bacteria isolate, SK-1, which produced high extracellular chitinase activity, was isolated from soil in Angthong Province, Thailand, optimum for growth for SK-1 in LB medium was at pH 7.5 and at 50 ℃. SK-1 can also grow in medium containing NaCl from 0 to 10% (optimum, 1% NaCl). The properties of the isolate, such as the formation of endospore, having peritrichous figella, and the partial 16S ribosomal RNA sequence, indicated that it belongs to Bacillus licheniformis. The enzyme production from B. licheniformis SK-1, in 0.02% colloidal chitin minimum medium, was found during log phase. The optimum for enzyme production from B. licheniformis SK-1 was cultured in 0.08%CCMM, pH 7.5 at 50 ℃. Crude enzyme contains at least 2 activities, a high activity chitinase, and chitobiase. The optimum pH and temperature of crude enzyme was 6.0/60 ℃. B. licheniformis SK-1 chitinase can hydrolyze regenerated chitin the best followed by, colloidal chitin, powdered chitin, partially N-acetylated chitin, chitosan, and flaked chitin, respectively. Products from this enzyme, analyzed by HPLC, a mixture of Nacetylglucosamine (GlcNAc) and chitobiose (GlcNAc)2. SDS-PAGE analysis of crude enzyme from culture medium from B. licheniformis SK-1 following by activity staining, using glycol chitin as substrate, eight chitinolytic activity bands were observed with molecular weight ranging from 20 to 72 kDa. Chitinase was partially purified from the culture medium of B. licheniformis SK-1 by colloidal chitin affinity adsorption followed by DEAE-cellulose column chromatography. The partial purified enzyme showed a single protein band on native polyacrylamide gel electrophoresis. The isoelectric point of the major component in the partial purified chitinase was 4.62. The partial purified chitinase showed a major band with MW 72 kDa and 2 minor bands with MW 58, 70 kDa on SDS-PAGE, respectively. The partial purified chitinase revealed two activity optima at pH is 6 and 8 when colloidal chitin was used as substrate and was stable in pH 6-8. The partial purified enzyme exhibited a broad activity temperatures ranging between 40 to 70 ℃, with optimum at 55 ℃ and retained 94%, 83 and 22% activity after heat at 40, 50 and 60 ℃ for 12 hrs, respectively. The Km and Vmax of the partial purified chitinase was 0.23 mg colloidal chitin m f' and 7.03 U mg-1. Shotgun cloning of the PstI partially cut genomic DNA of B. licheniformis SK-1 was investigated. After screening 5,000 transformants, no positive clones were found. Then the full length chitinase gene was amplified using primers, specific for Bacillus chitinase gene, BP-F and BP-R. The positive clone was screened on CCMM. The positive clone contained a plasmid with 2-kb insert fragment, pSKChi66. The plasmid pSKChi66 had one open reading of 1,797 bp which encoded a polypeptide of 598 amino acid residues, corresponding a to 66 kDa protein with an isoelectric point 5.02. The amino acid comparison indicated Chi66 is 84% similar to chitinase from B. subtilis TP-1 and chitinase from B. licheniformis. Crude chitinase from pSKChi66 was characterized. The optimum pH and temperature was pH 5.0 and 60 ℃. Crude enzyme hydrolyzed colloidal chitin the best followed by powdered chitin, PNAC, flaked chitin, chitosan and regenerated chitin, respectively. Determination of hydrolytic products by HPLC, found a NN’-diacetylchitobiose from colloidal chitin. SDS-PAGE analysis of chitinolytic enzyme from culture medium from recombinant clone showed three bands of protein with chitinase activity. The molecular weights were approximately 70, 65 and 58 kDa, which is similar with crude and partial purified enzyme from B. licheniformis SK-1.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

ได้ทำการแยกแบคทีเรียทนร้อนสายพันธุ์ SK-1 ที่สามารถผลิตไคทิเนสจากดินในจังหวัดอ่างทอง SK-1 เจริญได้ที่อุณหภูมิตั้งแต่ 30 ถึง 60 ℃ (มีอุณหภูมิที่เหมาะสมเป็น 50℃) เจริญได้ในอาหารที่มีค่า pH ตั้งแต่ 3 ถึง 10 (มีค่า pH ที่เหมาะสมเป็น 7.5) และเจริญได้ในอาหารที่มีเกลือโซเดียมคลอไรด์ตั้งแต่ 0 ถึง 10% (มีความเข้มข้นที่เหมาะสมเป็น 1 %) เมื่ออาศัยสมบัติบางประการทางกายภาพและทางชีวเคมี เช่น การสร้างเอนโคสปอร์ การมี peritrichous figella และการเปรียบเทียบลำดับเบสใน 16S rRNA พบว่าเป็นแบคทีเรียในจีนัส Bacillus ที่มีชื่อว่า Bacillus licheniformis โดยที่แบคทีเรียนี้สามารถผลิตเอนไซม์ได้มากที่สุดในในช่วง Log phase ของการเจริญเติบโตในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี 0.02% colloidal chitin ภาวะที่เหมาะสมในการผลิตเอนไซม์คือ เลี้ยงแบคทีเรียใน 0.08% CCMM, pH 7.5 ที่อุณหภูมิ 50℃ และผลิตเอนไซม์ได้ที่อุณหภูมิตั้งแต่ 30 ถึง 50 ℃ ในเอนไซม์หยาบประกอบด้วยเอนไซม์สองชนิดคือไคทีเนส และไคโทไบเอส ภาวะของการเร่งปฏิกิริยาที่ เหมาะสมของเอนไซม์หยาบที่ได้จากน้ำเลี้ยงแบคทีเรียมีค่า pH และอุณหภูมิเป็น 6.0 และ 60 ℃ โดยที่เอนไซม์สามารถย่อย regenerated chitin ได้ดีที่สุด การศึกษาผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการย่อย colloidal chitin ด้วยเอนไซม์ โดย HPLC พบว่าเอนไซม์หยาบสามารถย่อย colloidal chitin ได้ N-acetylglucosamine, และ N, N’-diacetyl chitobiose เป็นส่วนใหญ่ หลังจากวิเคราะห์ด้วยวิธี SDS-PAGE โดยทำการย้อมแอกติวิดีของเอนไซม์เปรียบเทียบกับแถบของโปรตีนที่ได้ พบว่ามีโปรตีนที่มีไคทีเนสแอกติวิดีอย่างน้อย 8 แถบที่มีนี้าหนักโมเลกุลตั้งแต่ 20 ถึง 72 กิโลดาลตัน เมื่อทำไคทีฌสให้บริสุทธิ์บางส่วนด้วยวิธีการดูดซับแบบจำเพาะด้วยคอลลอยคัลไคทินและคอลัมน์ DEAE และนำไปศึกษาสมบัติของไคทิเนสที่ บริสุทธิ์บางส่วน พบว่าไคทิเนสที่ได้จาก DEAE peak2 มีค่า pi เท่ากับ 4.62 และสามารถย้อมติดสีย้อมไคทิเนสใน SDS-PAGE ได้ทั้งหมด 3 แถบ ซึ่งมีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 72, 70 และ 58 กิโลดาลตัน pH และอุณหภูมิ ในการเร่งปฏิกิริยาคือ 5 และ 55 ℃ เอนไซม์เสถียรในช่วง pH 6-8 และที่อุณหภูมิ 40-50 ℃ เอนไซม์มีค่า Km และค่า Vmax ของเอนไซม์ต่อการย่อย colloidal chitin เป็น 0.23 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร และ 7.03 ยูนิตต่อมิลลิกรัม จากการทำการโคลนแบบ Shotgun ของชิ้นโครโมโซมมอลดีเอ็นเอของ B. licheniformis SK-1 ที่ตัดแบบไม่สมบรูณ์ ด้วย PstI หลังทำการดัดเลือกไปแล้ว 5,000 โคโลนี ไม่พบโคลนที่ให้ผลบวกบนอาหารแข็งที่มี colloidal chitin จึงได้ทำการเปลี่ยนวิธีโคลนโดยใช้วิธีเพิ่มจำนวนชิ้นยีนไคทีเนสด้วยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่เฉพาะต่อยีนไคทิเนสของแบคทีเรียในกลุ่ม Bacillus คือ BP-F และ BP-R แล้วโคลนเข้าสู่ pGEM-T easy ทำการดัดเลือกบนอาหารแข็งที่มี colloidal chitin พบโคโลนีที่ให้วงใสบนอาหารแข็งที่มีพลาสมิดที่มีชิ้น insert ขนาด 2 กิโลเบส, pSKChi66 พลาสมิด pSKChi66 มี 1 ORF ที่มีขนาค 1,797 คู่ เบส ซึ่งแปลเป็นรหัสโปรตีนที่ประกอบด้วยกรดอะมิโน 598 ตัวที่มีน้ำหนักโมเลกุล 66 กิโลดาลตัน และมีค่า pI เท่ากับ 5.02 ลำดับของกรดอะมิโนที่ได้มีความคล้ายคลึงกับลำดับของกรดอะมิโนของไคทิเนสจาก B. subtilis และ B. licheniform is 84% เอนไซม์ที่ได้จาก pSKChi66 มีค่า pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการเร่งปฏิกิริยาเป็น 5 และ 60 ℃ โดยที่เอนไซม์สามารถย่อย colloidal chitin ได้ดีที่สุด การศึกษาผลิตภัณฑ์ของการย่อย colloidal chitin ด้วยเอนไซม์ โดย HPLC พบว่าเอนไซม์หยาบสามารถย่อย colloidal chitin ได้ N, N’-diacetyl chitobiose เป็นส่วนใหญ่ ไคทิเนสที่ได้จาก pSKChi66 สามารถย้อมติคสีย้อมไคทิเนสใน SDS-PAGE ได้ทั้งหมด 3 แถบ ซึ่งมีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 70, 65 และ 58 กิโลดาลตัน

Link to Full Text

Share

COinS