Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

การตรวจวินิจฉัยแยกชนิดเชื้อบิดในไก่ด้วยวิธี PCR-RFLP

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

Species differentiation of eimeria in chicken by PCR-RFLP

Year (A.D.)

2004

Document Type

Thesis

First Advisor

นารีรัตน์ วิเศษกุล

Second Advisor

สุวรรณี นิธิอุทัย

Third Advisor

สุดจิตต์ จุ่งพิวัฒน์

Faculty/College

Faculty of Veterinary Science (คณะสัตวแพทยศาสตร์)

Degree Name

วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Degree Level

ปริญญาโท

Degree Discipline

พยาธิชีววิทยาทางสัตวแพทย์

DOI

10.58837/CHULA.THE.2004.1801

Abstract

โรคบิดในไก่เป็นโรคโปรโตซัวมีสาเหตุมาจากเชื้อบิดในสกุล Eimeria โดยทั่วไปพื้นฐานของการตรวจแยกชนิดเชื้อบิดในไก่เป็นการแยกจากลักษณะรูปร่างของเชื้อบิดและบริเวณตำแหน่งในลำไส้ของไก่ที่ติดเชื้อบิด ซึ่งจากหลักการนี้พบว่าการตรวจแยกความแตกต่างชนิดของเชื้อบิดในบางครั้งให้ผลไม่น่าเชื่อถือ จึงได้มีการพัฒนานำวิธี Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphisms (PCR-RFLP) มาใช้เพื่อแยกชนิดเชื้อบิด โดยเพิ่มปริมาณ DNA ตรงบริเวณ 18S ribosomal RNA gene (18S rRNA gene) ได้ผลิตภัณฑ์ PCR ขนาด 422 bp และนำผลิตภัณฑ์ PCR มาแยกชนิดเชื้อบิดด้วยเอ็นไซม์ตัดจำเพาะ ได้แก่ Alu I, Hha I, Hpa II และ Hae III โดยความไวของวิธี PCR นั้นอยู่ที่ 0.12 โอโอซีสต์ และความไวของวิธี PCR-RFLP อยู่ที่ 8 โอโอซีสต์ และวิธีนี้ยังมีความจำเพาะต่อเชื้อบิด Eimeria มากที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับ DNA ที่สกัดจากปรสิตในระบบทางเดินอาหารของไก่และแพะ ได้แก่ Raillietina cesticillus, R. chinobothrida, R. Tetragona, Ascaridia galli, Gongglonema spp., Heterakis gallinae, Tetrameres spp. และ Trichostronglylus spp. จากการศึกษาแยกชนิดเชื้อบิด E. tenella CD38 ประกอบด้วยเชื้อบิด 3 ชนิด คือ E. tenella มีปริมาณสัมพันธ์มากที่สุดคือ 64%, E. necatrix 32% และ E. maxima 4% และเชื้อบิดที่ประกอบอยู่ในวัคซีนเชื้อเป็น Immucox[superscript (R)] (I) มีอย่างน้อย 4 ชนิด คือ E. acervulina มีปริมาณสัมพันธ์มากที่สุดคือ 26%, E. maxima 19%, E. necatrix 3% และ E. tenella 3% โดยการแยกชนิดของเชื้อบิด E. tenella CB38 ที่กระจายอยู่ตามลำไส้ส่วนต่างๆ ได้แก่ ลำไส้ส่วนต้น พบเชื้อบิด 2 ชนิด คือ E. acervulina ปริมาณสัมพันธ์ 84% และ E. tenella 6% ลำไส้ส่วนกลางที่ 1 พบเชื้อบิด 4 ชนิด ได้แก่ E. necatrix ปริมาณสัมพันธ์ 26%, E. acervulina 21%, E. tenella 14% และ E. maxima 6% ลำไส้ส่วนกลางที่ 2 พบเชื้อบิด 3 ชนิดคือ E. maxima ปริมาณสัมพันธ์ 69%, E. necatrix 7% และ E. tenella 6% ลำไส้ส่วนท้าย พบเชื้อบิดได้ 3 ชนิดคือ E. maxima ปริมาณสัมพันธ์ 73%, E. necatrix 16% และ E. tenella 7% และไส้ตันพบเชื้อบิดได้ 3 ชนิด คือ E. tenella ปริมาณสัมพันธ์ 52%, E. necatrix 43% และ E. maxima 4% ส่วนไก่ที่ติดเชื้อบิดจากวัคซีนเชื้อเป็น Immucox[superscript (R)] (I) สามารถแยกชนิดเชื้อบิดที่บริเวณลำไส้ส่วนต้นได้ 2 ชนิด คือ E. acervulina ปริมาณสัมพันธ์ 73% และ E. maxima 3% ลำไส้ส่วนกลางที่ 1 พบเชื้อบิด 2 ชนิด คือ E. maxima ปริมาณสัมพันธ์ 90% และ E. tenella 6% ลำไส้ส่วนกลางที่ 2 พบเชื้อบิด 2 ชนิด คือ E. maxima ปริมาณสัมพันธ์ 94% และ E. tenella 6% ลำไส้ส่วนท้าย พบเชื้อบิด 2 ชนิดคือ E. maxima ปริมาณสัมพันธ์ 87% และ E. tenella 8% และไส้ตัน พบเชื้อบิด 3 ชนิด คือ E. necatrix ปริมาณสัมพันธ์ 45%, E. tenella 40% และ E. maxima 13% ดังนั้นวิธี PCR-RFLP สามารถใช้แยกความแตกต่างทางพันธุกรรมของเชื้อบิดในไก่ได้ โดยมีความไวและความจำเพาะที่เหมาะสมในการนำมาประยุกต์ใช้ตรวจวินิจฉัยและยังสามารถยืนยันได้ว่าพบเชื้อบิด E. tenella หรือ E. maxima ได้ทุกบริเวณของลำไส้ไก่อีกด้วย

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

Avian coccidiosis is a protozoan disease caused by the genus Eimeria. Basically, species of Eimeria in chicken is distinguished by the distinct morphology and parasitic deposited sites in intestine of the infected animals. The criteria of Eimeria species differentiation when the disease occured is sometime unreliable. Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was developed to differentiate species of Eimeria. The conserved region of 18S ribosomal RNA gene (18S rRNA gene) was amplified by PCR to yield the product of 422 bp. The RFLP patterns were analyzed by Alu I, Hha I, Hpa II and Hae III. The sensitivity of the PCR technique was to detect at least 0.12 oocysts and PCR-RFLP was able to give the RFLP patterns by using at least 8 oocysts. The specificity of PCR-RFLP was compared to DNA extracted from Raillietina cesticillus, R. Echinobothrida, R. Tetragona, Ascaridia galli ,Gongylonema spp., Heterakis gallinae, Tetrameres spp. และ Trichostronglylus spp. By using the technique of PCR-RFLP, E. tenella CB38 is a mixture of at least 3 Eimeria spp.; E. tenella 64%, E. necatrix 32% and E. maxima 4% while Immucox(I) comprises at least 4 species; E. acervulina 26%, E. maxima 19%, E. necatrix 3% and E. tenella 3%. To identify Eimeria spp. of E. tenella CB38 isolated from the upper part of the intestine revealed the combination of species E. acervulina 84% and E. tenella 6%. The proximal part of the intestine was infected with E. necatrix 26%, E. acervulina 21%, E. tenella 14% and E. maxima 6%. The distal part of the intestine was infected with E. maxima 69%, E. necatrix 7% and E. tenella 6%. The lower part of the intestine was infected with E. maxima 73%, E. necatrix 16% and E. tenella 7%. Lastly, caecum was infected with E. tenella 52%, E. necatrix 43% and E. maxima 4%. While the dentification of Eimeria spp. containing in the live-vaccine, Immucox(I), the upper part of the infected intestine revealed the combination of species; E. acervulina 73% and E. maxima 3%. The proximal part of the intestine was infected with E. maxima 90% and E. tenella 6%. The distal part of the intestine was infected with E. maxima 94% and E. tenella 6%. The lower part of the intestine was infected with E. maxima 87% and E. tenella 8%. Lastly, the caecum, it was infected with E. necatrix 45%, E. tenella 40% and E. maxima 13%. Therefore the technique of PCR-RFLP on 18S rRNA gene was able to perform a differential diagnosis of avian coccidiosis caused by Eimeria spp. Nonetheless, by using this method, E. tenella and E. maxima could be found in all part of the infected intestine.

Link to Full Text

Share

COinS