Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
การสังเคราะห์ไฟซีทินไกลโคไซด์โดยไซโคลเด็กซ์ทรินไกลโคซิลแทรนส์เฟอเรสจาก Paenibacillus sp. RB01
Year (A.D.)
2017
Document Type
Thesis
First Advisor
Manchumas Prousoontorn
Faculty/College
Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)
Department (if any)
Department of Biochemistry (fac. Science) (ภาควิชาชีวเคมี (คณะวิทยาศาสตร์))
Degree Name
Master of Science
Degree Level
Master's Degree
Degree Discipline
Biochemistry and Molecular Biology
DOI
10.58837/CHULA.THE.2017.23
Abstract
Fisetin is a flavonoid which was widely exerted in pharmacological industries. However, fisetin has low water solubility and unstable in aqueous solution. So the uses of fisetin have been limited. The purpose of this study was to increase water solubility of fisetin by transglycosylation reaction using cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) from Paenibacillus sp. RB01. The reaction had to perform in co-organic solvent system and DMSO at 40% (v/v) was proved to be the most suitable co-organic solvent since it provided the high enzyme stability and high production yield. Moreover, the types of glycosyl donor were also determined and β-cyclodextrin was found to be an appropriate glycosyl donor. The effects of fisetin, β-cyclodextrin, and enzyme concentration and incubation time on the fisetin glycoside synthesis were also determined. It was found that the optimum condition was to incubate 0.25% (w/v) of fisetin and 1.0% (w/v) of β-CD with 200 U/mL of CGTase at 40ºC for 24 hours. Under optimum condition, the percent conversion of fisetin (17.1% ± 4.21%) was significantly increased when compared to that of non-optimized condition (10.1% ± 1.15%). HPLC analysis showed that at least 5 fisetin glycosides were synthesized by CGTase. Structural analysis by glucoamylase and α-glucosidase revealed that fisetin linked with glucose through alpha-glycosidic bonds, while glucose molecules joined together by α-1, 4 glycosidic bond. The obtained fisetin glycoside products were purified by n-butyl acetate extraction and further refined by HPLC. LC-MS/MS revealed that CGTase synthesized two types of fisetin monoglucosides (m/z of 447), two types of fisetin diglucosides (m/z of 609) and one type of fisetin triglucoside (m/z of 771). Fragmentation patterns suggested two possible structures of fisetin monoglucoside products. The water solubility of three purified products were investigated. It was found that water solubility of fisetin glycosides increased at least 500 times higher than the parent fisetin. DPPH assay showed that the antioxidant activity of synthesized fisetin glycosides was not different when compared with fisetin.
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
ไฟซิทินเป็นสารฟลาโวนอยด์ที่ได้รับความนิยมอย่างกว้างขวางในอุตสาหกรรมเภสัชวิทยา แต่อย่างไรก็ตามไฟซิทินมีความสามารถในการละลายน้ำต่ำและไม่เสถียรในสารละลายที่มีน้ำ ทำให้การนำไฟซีทินไปใช้จึงมีข้อจำกัด ในการศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อเพิ่มความสามารถในการละลายน้ำของไฟซีทินโดยอาศัยปฏิกิริยาแทนรนส์ไกลโคซิเลชันโดยใช้เอนไซม์โคลเด็กซ์ทรินไกลซิลแทรนส์เฟอเรส (cyclodextrin glycosltransferase, CGTase) จากแบคทีเรีย Paenibacillus sp. RB01 ซื้อในปฏิกิริยานี้จำเป็นต้องใช้ระบบสารละลายอินทรีย์ร่วมด้วย และพบว่า DMSO ที่ร้อยละ 40 (v/v) เป็นสารละลายอินทรีย์ร่วมที่เหมาะสมที่สุดเนื่องจากให้ความคงตัวของเอนไซม์สูงและให้ผลผลิตสูง นอกจากนี้ยังศึกษาชนิดของตัวให้หมู่ไกลโคซิลและพบว่าบีตาไซโคลเด็กซ์ทรินเป็นตัวให้หมู่ไกลโคซิลที่เหมาะสม จากนั้นทำการศึกษาผลของความเข้มข้นของไฟซีทิน, บีตาไซโคลเด็กซ์ทรินและเอนไซม์ และระยะเวลาในการบ่มต่อการสังเคราะห์ไฟซีทินไกลโคไซด์ พบว่าสภาวะที่เหมาะสมคือกี่บ่ม 0.25% (w/v) ของบีตาไซโคลเด็กซ์ทรินกับ200 U/mL ของ CGTase ที่ 40 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ซึงภายใต้สภาวะที่เหมาะสมในการผลิตนี้มีเปอร์เซ็นต์การเปลี่ยนแปลงของไฟซีทิน (17.1% ± 4.21) สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับสภาวะที่ไม่เหมาะสม (10.1% ± 1.15) อย่างมีนัยสำคัญ ในการสังเคราะห์ผลิตภัณฑ์ไฟซีทินไกลโคไซด์โดย CGTase พบผลิตภัณฑ์ 5 ชนิด เมื่อวิเคราะห์ด้วย HPLC การวิเคราะห์โครงสร้างด้วยกลูโคสแอมิเลสและแอลฟากลูโคซิเดส พบว่าไฟซีทินเชื่อมต่อกับกลูโคสด้วยพันธะแอลฟา-ไกลโคไซด์ ขณะที่กลูโคสเองต่อกันด้วยพันธะ α-1, 4 ไกลโคซิเดส จากนั้นทำบริสุทธิ์ผลิตภัณฑ์ไฟซีทินไกลโคไซด์ที่ได้โดยการสกัดด้วย n-butyl acetate และแยกต่อด้วย HPLC เมื่อวิเคราะห์ด้วย LC-MS/MS พบว่า CGTase สามารถสังเคราะห์ไฟซีทินมอรอกลูโคไซด์ได้ 2 ชนิด (m/z ที่ 447), ไฟซีทินไกลโคไซด์ 2 ชนิด (m/z ที่ 609) 2 ชนิด และไฟซีทินไกลโคไซด์ 1 ชนิด (m/z ที่ 771) และรูปแบบการกระจายตัวบ่งชี้ว่าโครงสร้างของผลิตภัณฑ์ไฟซีทินไกลโคไซด์มีอยู่ 2 รูปแบ จากการศึกษาความสามารถในการละลายน้ำของผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์ทั้งสามชนิด พบว่าความสามารถในการละลายน้ำของไฟซีทินไกลโคไซด์เพิ่มขึ้นอย่างน้อย 500 เท่าเมื่อเทียบกับไฟซีทิน การวิเคราะห์โดย DPPH แสดงให้เห็นถึงกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระของไฟซีทินไกลโคไซด์ที่สังเคราะห์ได้นั้น ไม่แตกต่างกันเมื่อเปรียบเทียบกับไฟซีทิน
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
Lorthongpanich, Nattawadee, "Synthesis of fisetin glycosides by cyclodextrin glycosyltransferase from paenibacillus sp. Rb01" (2017). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 513.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/513