Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
Biodiesel production from free fatty acids of palm oil by two-step reaction using whole cell biocatalyst
Year (A.D.)
2019
Document Type
Thesis
First Advisor
วรวุฒิ จุฬาลักษณานุกูล
Faculty/College
Faculty of Science (คณะวิทยาศาสตร์)
Degree Name
วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต
Degree Level
ปริญญาโท
Degree Discipline
เทคโนโลยีชีวภาพ
DOI
10.58837/CHULA.THE.2019.617
Abstract
การผลิตไบโอดีเซลสามารถผลิตได้จากกรดไขมันอิสระของน้ำมันปาล์มโดยปฏิกิริยาสองขั้นตอนโดยใช้ตัวเร่งปฏิกิริยาชีวภาพทั้งเซลล์ ในการศึกษานี้ได้ใช้ยีสต์ Candida rugosa เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาชีวภาพทั้งเซลล์ เนื่องจากเชื้อยีสต์ดังกล่าวมีความสามารถในการไฮโดรไลซ์น้ำมันปาล์มไปเป็นกรดไขมันอิสระ โดยพบว่าได้กรดไขมันอิสระสูงสุดเท่ากับ 82.61 เปอร์เซ็นต์ หลังจากทำการเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 5 วัน จากนั้นกรดไขมันอิสระที่ผลิตโดย C. rugosa จะถูกนำไปใช้เป็นตัวเหนี่ยวนำในการผลิตเอนไซม์ลิเพสจากเชื้อ Aureobasidium pullulans var. melanogenum SRY 14-3 ซึ่งหลังจากการหาภาวะที่เหมาะสมพบว่าสามารถผลิตเอนไซม์ลิเพสที่มีค่าแอกทิวิตีและค่าแอกทิวิตีจำเพาะของเอนไซม์สูงสุด คือ 1.18 ยูนิตต่อมิลลิลิตร และ 17.28 ยูนิตต่อมิลลิกรัมโปรตีน ตามลำดับ โดยใช้ความเข้มข้นของกรดไขมันอิสระ 3 เปอร์เซ็นต์ ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 120 ชั่วโมง การศึกษาการผลิตไบโอดีเซลจากปฏิกิริยาเอสเทอริฟิเคชันที่เร่งปฏิกิริยาด้วย A. pullulans var. melanogenum SRY 14-3 พบว่าสามารถผลิตไบโอดีเซลได้สูงสุดเท่ากับ 21.39 เปอร์เซ็นต์ เมื่อใช้อัตราส่วนโดยโมลของกรดไขมันอิสระต่อเมทานอลเท่ากับ 1:1 ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 72 ชั่วโมง สำหรับการศึกษาตัวเร่งปฏิกิริยาชีวภาพทั้งเซลล์ด้วยการใช้เทคนิคการแสดงออกที่ผิวเซลล์ยีสต์ เอนไซม์ลิเพส 1 และเอนไซม์ลิเพส 3 จาก C. rugosa (CRL1 และ CRL3) และเอนไซม์ลิเพส จาก A. pullulans var. melanogenum SRY 14-3 (AML) ได้ถูกนำมาเชื่อมต่อกับโปรตีนฐาน PpPIR1 แล้วทำการโคลนเข้าสู่ยีสต์เจ้าบ้าน Pichia pastoris KM 71 ได้เป็นยีสต์ Pp-CRL1, Pp-CRL3 และ Pp-AML ตามลำดับ จากการศึกษาพบว่ายีสต์สายพันธุ์รีคอมบิแนนท์ Pp-CRL1 และ Pp-CRL3 สามารถผลิตเอนไซม์ลิเพสที่ผิวเซลล์สูงสุดเท่ากับ 1,499.9 มิลลิยูนิตต่อOD600 และ 181.96 มิลลิยูนิตต่อOD600 หลังจากการเหนี่ยวนำด้วยเมทานอลความเข้มข้น 2 เปอร์เซ็นต์ โดยปริมาตร เป็นเวลา 5 และ 4 วัน ตามลำดับ ในส่วนของสายพันธุ์รีคอมบิแนนท์ Pp-AML พบว่าให้ค่าแอกทิวิตีของเอนไซม์ลิเพสที่ผิวเซลล์สูงสุด เท่ากับ 30.48 มิลลิยูนิตต่อOD600 หลังจากการเหนี่ยวนำด้วยเมทานอล 1 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 3 วัน นอกจากนี้ยังพบว่าความเป็นกรดด่างและอุณหภูมิที่เหมาะสมของเอนไซม์ลิเพสของยีสต์สายพันธุ์รีคอมบิแนนท์ Pp-CRL1, Pp-CRL3 คือที่พีเอช 7 และอุณหภูมิ 50 และ 40 องศาเซลเซียส ตามลำดับ ในขณะที่ความเป็นกรดด่างและอุณหภูมิที่เหมาะสมของเอนไซม์ลิเพสของ Pp-AML คือค่าพีเอชเท่ากับ 8 ที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส ตามลำดับ หลังจากการนำ Pp-CRL1 และ Pp-CRL3 ไปเป็นตัวเร่งปฏิกิริยาไฮโดรไลซิสน้ำมันปาล์มที่อัตราส่วนต่างๆ พบว่าการใช้ Pp-CRL1 เพียงชนิดเดียวสามารถเร่งปฏิกิริยาไฮโดรไลซิสได้ผลผลิตกรดไขมันสูงสุดเท่ากับ 14.26 เปอร์เซ็นต์ ที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 48 ชั่วโมง สำหรับการใช้ Pp-AML เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาเอสเทอริฟิเคชันของกรดไขมันอิสระนั้นจะทำการทดสอบต่อไปในอนาคต
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
Biodiesel production can be produced from free fatty acids of palm oil by two-step reaction using whole cell biocatalyst. This study utilized yeast Candida rugosa as the whole cell biocatalyst because it has ability to hydrolyze palm oil into free fatty acids (FFAs). The highest conversion of FFAs by C. rugosa was 82.61% after 5-day cultivation. Then, FFAs produced by C. rugosa were utilized as an inducer for extracellular lipase production of Aureobasidium pullulans var. melanogenum SRY 14-3. After optimization, the highest lipase volumetric activity and lipase specific activity of 1.18 U/mL and 17.28 U/mg protein were obtained by using 3% w/v FFAs at 30 ºC for 5 days, respectively. Subsequently, the study of esterification by A. pullulans var. melanogenum SRY 14-3 revealed that the highest biodiesel conversion yield of 21.39% was achieved when FFAs concentration to methanol molar ratio of 1:1 was employed at 30°C, 72 h. For whole cell biocatalysts using yeast cell surface display technique, Lipase1 and Lipase3 genes from C. rugosa (CRL1 and CRL3) and Lipase gene from A. pullulans var. melanogenum SRY 14-3 (AML) were fused with PpPIR1 anchor protein and then cloned into Pichia pastoris KM71 host strain to construct Pp-CRL1, Pp-CRL3 and Pp-AML, respectively. It was found that the recombinant yeast Pp-CRL1 and Pp-CRL3 strains produced the highest lipase activity on cell surface of 1,499.9 mU/OD600 and 181.9 mU/OD600 at 5 and 4 days of induction with 2% v/v methanol, respectively. For the recombinant Pp-AML strains, the highest lipase activity on cell surface was achieved at 30.48 mU/OD600 after 3 days of induction with 1% v/v methanol. In addition, the optimal pH and temperature of lipase activity of recombinant yeast Pp-CRL1 and Pp-CRL3 were pH 7 and 50°C and 40°C, respectively. On the contrary, the optimal pH and temperature of lipase activity of Pp-AML was observed at pH 8 and 35°C, respectively. After hydrolysis of palm oil by using Pp-CRL1 and Pp-CRL3 at different combinations, our results suggested that the use of Pp-CRL1 alone was able to produce the highest FFAs yield of 14.26% at 45°C for 48 h. The study of the esterification of FFAs by using Pp-AML as whole cell will be further evaluated.
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
หวั่งประดิษฐ์, ฐนิสา, "การผลิตไบโอดีเซลจากกรดไขมันอิสระของน้ำมันปาล์มโดยปฏิกิริยาสองขั้นตอนโดยใช้ตัวเร่งปฏิกิริยาชีวภาพทั้งเซลล์" (2019). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 8993.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/8993