Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
จีโนม คุณสมบัติทางเคมีกายภาพ และการโคลนยีนเอสเทอเรสของเลนติบาซิลลัสและฮาโลบาซิลลัสสปีชีส์ใหม่
Year (A.D.)
2019
Document Type
Thesis
First Advisor
Somboon Tanasupawat
Second Advisor
Wonnop Vissessanguan
Third Advisor
Plearnpis Luxananil
Faculty/College
Faculty of Pharmaceutical Sciences (คณะเภสัชศาสตร์)
Department (if any)
Department of Food and Pharmaceutical chemistry (ภาควิชาอาหารและเภสัชเคมี)
Degree Name
Doctor of Philosophy
Degree Level
Doctoral Degree
Degree Discipline
Pharmaceutical Chemistry and Natural Products
DOI
10.58837/CHULA.THE.2019.406
Abstract
A total of 831 moderately halophilic bacteria isolated from various samples in Thailand were screened for their lipolytic activity. Three hundred and forty-nine isolates showed activity on agar plate while 322 isolates exhibited in broth. The grouping and identification of 322 isolates based on DNA-fingerprinting using (GTG)5+ERIC2 primer and 16S rRNA gene sequence, 180 DNA patterns could be generated. The result indicated that the representative isolates belonged to genera Bacillus, Halobacillus, Lentibacillus, Marinobacter, Thallossobacillus, and Virgibacillus. On the basis of polyphasic taxonomic study and genome analysis, a selected moderately halophilic strain SSKP1-9T, Gram-staining-positive, aerobic, endospore-forming, rod-shaped was closely related to Lentibacillus juripiscarius TISTR 1535T and L. halophilus TISTR 1549T, 98.7 and 97.2%, respectively based on 16S rRNA gene sequence similarity. On the basis of these results, the strain represents a novel species of the genus Lentibacillus, for which the name Lentibacillus lipolyticus is proposed (SSKP1-9T=JCM 32625T=TISTR 2597T). A Gram-staining-positive, aerobic, endospore-forming, rod-shaped, strain SKP4-6T was closely related to Halobacillus salinus JCM 11546T, H. locisalis KCTC 3788T and H. yeomjeoni KCTC 3957T, with 98.6% respectively, based on 16S rRNA gene sequence similarity. On the basis of these results taxonomy and whole-genome analysis, strain SKP4-6T represents a novel species of the genus Halobacillus, for which the name Halobacillus fulvus is proposed (SKP4-6T =JCM 32624T=TISTR 2595T). Based on whole-genome analysis, strain SSKP1-9T and SKP4-6T contained protein-encoding esterase for 8 and 5 genes, respectively. The genes were then cloned into the pSaltExSePR5 plasmid and transferred to Bacillus subtilis WB800. Two recombinant, >APNFEMBD_02578-C112-40 from strain SSKP1-9T and >NKILIEJB_01195-C9-35 from strain SKP4-6T showed the highest esterase activity and were therefore studied. These two genes identified major matches with closely related to a member of family acyl-CoA thioesterase and the alpha/beta hydrolase fold founded in genus Lentibacillus and Halobacillus, respectively. Of the two recombinant enzymes, the first one has a molecular weight of 16.2 kDa, and the other was 27.7 kDa, identical to the predicted protein size from the amino acid sequence. Two recombinant enzymes reached the maximum activity at 15-30% NaCl, and the highest activity was shown at 22 % NaCl. The recombinant >APNFEMBD_02578-C112-40 displayed the activity around 25-60 °C, and the maximum activity was observed at 40-55 °C while >NKILIEJB_01195-C9-35 had optimal activity at 55 °C and lost its activity rapidly above 65 °C of the remaining activity. They stable in NaCl concentration above 17% (w/v) after incubated at 55 °C for 1 hr. Two enzymes showed good stability and remained activity about 80% in a temperature range of 5-45 °C after 1 hr of incubation at 50 °C with or without NaCl. Theses enzymes reached high activity over a wide range of pH from 6.0 to 9.0, recording maximal activity at pH 7.0-8.0 and displayed excellent stable in with or without NaCl at various pH ranges (pH 6.0 to 9.0). Besides, the two recombinant enzymes were found to have higher esterase activity against p-nitrophenyl butyrate (C4:0) comparing to other esters substrate. Based on finding results, two recombinant enzymes were classified as halophilic and thermophilic esterase
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
แบคทีเรียชอบเค็มปานกลางจำนวน 831 ไอโซเลทที่คัดแยกได้จากตัวอย่างหลายชนิดในประเทศไทยถูกนำมาคัดกรองกิจกรรมของเอนไซม์ย่อยไขมัน พบว่า 349 ไอโซเลทมีกิจกรรมบนอาหารแข็ง และ 322 ไอโซเลทมีการผลิตเอนไซม์ในอาหารเหลว การศึกษาการจัดกลุ่มและพิสูจน์เอกลักษณ์โดยการใช้ผลลายพิมพ์ดีเอ็นเอโดยใช้คู่ของไพรเมอร์ (GTG)5+ERIC2 และผลการวิเคราะห์ 16S rRNA ของ 322 ไอโซเลท สามารถจัดกลุ่มได้ 180 รูปแบบ และพิสูจน์เอกลักษณ์ได้เป็นแบคทีเรียในจีนัส Bacillus, Halobacillus, Lentibacillus, Marinobacter, Thalassobacillus และ Virgibacillus จากผลการศึกษาลักษณะอนุกรมวิธานแบบโพลีฟาสิกและการวิเคราะห์จีโนมของสายพันธุ์ที่คัดเลือก ได้แก่ สายพันธุ์ SSKP1-9T มีรูปร่างแท่ง ชอบอากาศ สร้างสปอร์ ย้อมติดสีแกรมบวก การวิเคราะห์ยีนบริเวณ 16S rRNA พบว่าใกล้เคียงกับ Lentibacillus juripiscarius TISTR 1535T (98.7%) และ L. halophilus TISTR 1549T (97.2%) โดยผลการศึกษาชี้ให้เห็นว่าสายพันธุ์ SSKP1-9T เป็นแบคทีเรียชอบเค็มปานกลางสปีชีส์ใหม่ในจีนัส Lentibacillus จึงตั้งชื่อว่า Lentibacillus lipolyticus (SSKP1-9T=JCM 32625T=TISTR 2597T) ส่วนสายพันธุ์ SKP4-6T มีรูปร่างแท่ง สร้างสปอร์ ชอบอากาศ ย้อมติดสีแกรมบวก ผลการวิเคราะห์ยีนบริเวณ 16S rRNA ใกล้เคียงกับ Halobacilus salinus JCM 11546T, H. locisalis KCTC 3788T และ H. yeomjeoni KCTC 3957T เท่ากับ 98.6% ผลการศึกษานี้และการวิเคราะห์จีโนมชี้ให้เห็นว่าสายพันธุ์ SKP4-6T เป็นแบคทีเรียสปีชีส์ใหม่ในจีนัส Halobacillus จึงตั้งชื่อว่า Halobacillus fulvus (SKP4-6T=JCM 32624T=TISTR 2595T) ผลการวิเคราะห์ข้อมูลจีโนมของสายพันธุ์ SSKP1-9T และ SKP4-6T พบยีนที่เกี่ยวข้องกับการผลิตเอนไซม์เอสเทอเรสที่น่าสนใจจำนวน 8 และ 5 ยีนตามลำดับ จึงได้นำยีนดังกล่าวมาทำการโคลนเข้าสู่พลาสมิด pSaltExSePR5 และถ่ายโอนเข้าสู่ Bacillus subtilis WB800 รีคอมบิแนนท์โคลน APNFEMBD_02578-C112-40 จากสายพันธุ์ SSKP1-9T และ NKILIEJB_01195-C9-35 จากสายพันธุ์ SKP4-6T แสดงกิจกรรมของเอนไซม์เอสเทอเรสสูงที่สุดจึงนำไปศึกษาต่อ ยีน APNFEMBD_02578-C112-40 มีความคล้ายคลึงกับโปรตีนในแฟมิลี acyl-CoA thioesterase ที่พบในจีนัส Lentibacillus และยีน >NKILIEJB_01195-C9-35-40 มีความคล้ายคลึงกับโปรตีนในแฟมิลี alpha/beta hydrolase fold ที่พบในจีนัส Halobacillus ยีนทั้งสองมีน้ำหนักโมเลกุลจากการคำนวณลำดับกรดอะมิโนเท่ากับ 16.2 kDa และ 27.7 kDa ตามลำดับ และแสดงกิจกรรมสูงสุดที่ความเข้มข้นเกลือโซเดียมคลอไรด์ในช่วง 15-30% มีกิจกรรมสูงสุดที่ความเข้มข้น 22% เอนไซม์จากโคลน APNFEMBD_02578-C112-40 แสดงกิจกรรมในช่วง 25-60 องศาเซลเซียส มีกิจกรรมสูงสุดที่ 40-55 องศาเซลเซียส ในขณะที่เอนไซม์จากโคลน NKILIEJB_01195-C9-35 มีกิจกรรมสูงที่สุดที่ 55 องศาเซลเซียส และสูญเสียกิจกรรมอย่างรวดเร็วที่อุณหภูมิสูงกว่า 65 องศาเซลเซียส เอนไซม์ทั้งสองแสดงกิจกรรมที่สูงในช่วงพีเอชตั้งแต่ 6.0 ถึง 9.0 และมีกิจกรรมสูงสุดพีเอช 7.0-8.0 ตามลำดับ เอนไซม์มีความเสถียรหลังจากบ่มที่ 55 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ในสภาวะที่มีความเข้มข้นเกลือโซเดียมคลอไรด์สูงกว่า 17% และยังคงทำงานได้ประมาณ 80% ในช่วงอุณหภูมิ 5-45 องศาเซลเซียส พีเอช 6.0 ถึง 9.0 ทั้งในสภาวะที่มีหรือไม่มีเกลือโซเดียมคลอไรด์ นอกจากนี้ยังพบว่ารีคอมบิแนนท์เอนไซม์ทั้งสองชนิดมีความจำเพาะสูงต่อสารตั้งต้นประเภทเอสเทอร์ชนิดคาร์บอนสายสั้น จากผลการศึกษาเบื้องต้นจึงน่าจะระบุได้ว่ารีคอมบิแนนต์เอนไซม์ที่ผลิตจากทั้งสองโคลนมีความน่าจะเป็นเอนไซม์เอสเทอเรส ชอบเกลือ และทนอุณหภูมิสูง
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
Booncharoen, Auttaporn, "Genome, physicochemical properties and esterase gene cloning of novel lentibacillus and halobacillus species" (2019). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 8782.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/8782