Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

ผลและกลไกของเชื้อไวรัสพีอาร์อาร์เอสไทป์ 1 และไทป์ 2 ต่อการยอมให้ซึมผ่านระหว่างเซลล์และการอยู่รอดของเซลล์เยื่อบุมดลูกสุกร

Year (A.D.)

2017

Document Type

Thesis

First Advisor

Sutthasinee Poonyachoti

Second Advisor

Chatsri Deachapunya

Third Advisor

Suphot Wattanaphansak

Faculty/College

Faculty of Veterinary Science (คณะสัตวแพทยศาสตร์)

Department (if any)

Department of Physiology (fac. Veterinary Science) (ภาควิชาสรีรวิทยา (คณะสัตวแพทยศาสตร์))

Degree Name

Master of Science

Degree Level

Master's Degree

Degree Discipline

Animal Physiology

DOI

10.58837/CHULA.THE.2017.3

Abstract

Both PRRSV types 1 and 2 revealed the sign of reproductive disorders associated with a lesion at implantation sites. Impairment of maternal glandular endometrium cell integrity and function by PRRSV infection may impact a proper nourishing fetus. This research was aimed to examine the effects of PRRSV type 1 and type 2 directly on the viability and barrier function of the endometrium using porcine glandular endometrial epithelial cell culture (PEG). The comparison of the route and the strain of PRRSV infection coinciding with their virulent in reproductive epithelia were considered. PEG cells isolated from the 4-6 months old PRRSV-free-herd gilts (n=7 pigs) were cultured in standard media DMEM with 5% fetal bovine serum until 90% confluent. The fresh isolated PRRSV type 1 and type 2 (at TCID100/2 ml) inoculated to either apical or basolateral site of PEG cells for 1 h. The cytopathic effect (CPE) was observed daily. The permeability assessment of barrier function, the measurement of FITC dextran 4 kDa (FD-4) flux and transepithelial electrical resistance (TER), were performed at 0, 2, 4 and 6 days post infection (dpi). The expression of TJ protein genes; Cldn 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 and ZO-1 were detected by real-time qPCR and normalized with GAPDH at 4 dpi. The viability was determined by MTT assay and annexin V/propidium iodide (PI) assay at 0, 2, 4 and 6 dpi. All PRRSV inoculations to PEG cells produced a various CPE formation upon the inoculation. Apical inoculation with PRRSV type 2 decreased TER and increased FD-4 flux at 4 dpi (p<0.05). This indicates the cytotoxicity of PRRSV type 2 infection. In contrast, basolateral inoculation of PRRSV type 1 and 2 had no effects but maintained the integrity of the TJ barrier reflected by the stable of FD-4 flux through 6 dpi (p<0.05). Both viruses seem to increase the barrier function by up-regulating the barrier builder TJ Cldn5 but down-regulating the pore-forming TJ Cldn7 (p<0.05). The additional TJs gene was differently a target of PRRSV type 1 and 2 infections; Cldn3 and Cldn8 for PRRSV type 1 vs. ZO-1 for PRRSV type 2. However, the alteration of TJs expression induced by PRRSV was not relevant to their effects on TJs barrier functions. In the viability test, PRSSV type 2 increased cell proliferation, although the necrotic cell was concomitantly detected at 2 and 4 dpi (p<0.05). A few necrotic cells were also founded by PRRSV type 1 infection at 2 dpi. All of the cytotoxicity or proliferative effects were recovered at 6 dpi in all PRRSV infected PEG. However, whether the recovery PEG cell has a proper function is suspicious. The conclusion from our findings is PRRSV type 2 has more severity on the TJs barrier leaky and cell death than type 1 PRRSV in porcine endometrium. Since PRRSV can disturb TJs mRNA expression associated with necrosis, mucosal contamination or inoculation with PRRSV may be at risk or associated with PRRSV-induced reproductive disorders.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

ไวรัสพีอาร์อาร์เอสทั้งสองชนิด คือ ไทป์ 1 และไทป์ 2 ซึ่งทำให้เกิดระบบสืบพันธุ์ล้มเหลวพบว่ามีความสัมพันธ์กับรอยโรคบริเวณที่มีการฝังตัวของตัวอ่อน การสูญเสียความแข็งแรงและการทำหน้าที่ของเยื่อบุมดลูกส่วนต่อมของแม่สุกรอาจกระทบต่อการขนส่งอาหารไปให้ลูก งานวิจัยนี้มีเป้าหมายที่จะตรวจสอบผลโดยตรงของไวรัสพีอาร์อาร์เอสไทป์ 1 และไทป์ 2 ต่อความอยู่รอดและการทำหน้าที่เป็นปราการของเยื่อบุมดลูก โดยใช้เยื่อบุมดลูกสุกรส่วนต่อม การเปรียบเทียบเส้นทางในการติดเชื้อและสายพันธุ์ของไวรัสไปพร้อมกับประเมินความรุนแรงของไวรัสต่อเซลล์เยื่อบุทางเดินสืบพันธุ์จะถูกพิจารณาด้วย
เซลล์เยื่อบุมดลูกสุกรถูกแยกจากมดลูกสุกรอายุ 4-6 เดือนซึ่งได้รับจากฝูงสุกรที่ไม่พบการระบาดของโรคพีอาร์อาร์เอส (จำนวนตัวอย่างจาก 7 สุกร) นำมาเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อมาตรฐานที่มีซีรัมลูกวัวร้อยละ 5 จนกระทั่งเซลล์โตร้อยละ 90 ของภาชนะ ไวรัสพีอาร์อาร์เอสไทป์ 1 และไทป์ 2 ซึ่งถูกแยกสดใหม่และคำนวณปริมาณไวรัสที่ทำให้เซลล์ติดเชื้อได้ร้อยละ 100 ในปริมาตร 2 มิลลิลิตร นำมาบ่มที่ด้านยอดหรือด้านฐานเป็นเวลา 1 ชั่วโมง สังเกตการเกิดซีพีอีทุกวัน ประเมินความสามารถในการซึมผ่านด้วยสารโมเลกุลใหญ่ FD-4 และวัดค่าความต้านทานทางไฟฟ้าของเยื่อบุผิว (TER) ณ วันที่ 0, 2, 4 และ 6 หลังจากทำให้ติดเชื้อ วัดการแสดงออกของไทต์จังก์ชันยีนซึ่งประกอบไปด้วย คลอดิน1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 และโซนูลาออกคลูดิน1 ด้วยวิธี qPCR เปรียบเทียบกับ GAPDH ณ วันที่ 4 หลังทำให้ติดเชื้อ และวัดการอยู่รอดของเซลล์ด้วยวิธี MTT และย้อมสี annexin V/PI ที่วันที่ 0, 2, 4 และ 6 หลังทำให้ติดเชื้อ ผลการศึกษาพบว่าเชื้อไวรัสพีอาร์อาร์เอสทำให้เซลล์เยื่อบุมดลูกเกิดซีพีอีชนิดต่าง ๆ ได้หลังจากเริ่มบ่มเชื้อไว้ การบ่มไวรัสไทป์ 2 ทางด้านยอดของเซลล์ทำให้ความต้านทานของเยื่อบุลดลง และเพิ่มการซึมผ่านของ FD-4 ในวันที่ 4 (p<0.05) บ่งชี้ถึงการติดเชื้อไวรัสไทป์ 2 ทำให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์เยื่อบุมดลูก ในทางตรงข้ามการติดเชื้อไวรัสทั้งสองสายพันธุ์ที่ด้านฐานไม่ส่งผลให้เกิดความเสียหายใด แต่สามารถรักษาความแข็งแรงของเยื่อบุได้จนถึงวันที่ 6 และไม่พบการเปลี่ยนแปลงของการซึมผ่านของ FD-4 (p<0.05) ไวรัสทั้งสองสายพันธุ์ดูเหมือนจะเพิ่มการทำงานของไทต์จังก์ชันโดยเพิ่มการแสดงออกของโปรตีนที่สร้างความแข็งแรงคือ คลอดิน5 แต่ลดการแสดงออกของโปรตีนที่ทำให้เกิดช่องคือ คลอดิน7 นอกจากนี้ยังพบว่ามีไทต์จังก์ชันยีนอื่นที่เป็นเป้าหมายของไวรัสแตกต่างกันไปตามสายพันธุ์ ได้แก่ คลอดิน3 และ 8 เป็นเป้าหมายของไวรัสพีอาร์อาร์เอสไทป์ 1 ส่วน ZO-1 เป็นเป้าหมายของไวรัสพีอาร์อาร์เอสไทป์ 2 อย่างไรก็ตามการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของไทต์จังก์ชันยีนไม่สัมพันธ์กับการผลของไวรัสต่อการทำงานของไทต์จังก์ชัน ส่วนผลของการอยู่รอดของเซลล์ พบว่าไวรัสไทป์ 2 เพิ่มจำนวนเซลล์เยื่อบุมดลูก แม้ว่าการตายแบบ necrosis จะเกิดไปด้วยกันในวันที่ 2 และ 4 (p<0.05) โดยในวันที่ 2 กลุ่มที่ติดเชื้อไวรัสไทป์ 1 ตรวจพบการตายแบบ necrosis เล็กน้อย ผลของการติดเชื้อไวรัสต่อการตายและการเพิ่มจำนวนเซลล์จะกลับเข้าสู่ปกติในวันที่ 6 หลังจากติดเชื้อของทุกกลุ่มการทดลอง อย่างไรก็ตามเซลล์เยื่อบุมดลูกสุกรที่ฟื้นตัวจากติดเชื้อไวรัสนั้นจะมีการทำงานที่เป็นปกติยังเป็นที่น่าสงสัย การศึกษาครั้งนี้สามารถสรุปได้ว่าไวรัสพีอาร์อาร์เอสไทป์ 2 ก่อโรคในแง่ของการทำให้เกิดการรั่วของเยื่อบุและการตายของเซลล์ได้รุนแรงกว่าไวรัสไทป์ 1 และไวรัสยังสามารถทำให้เกิดความผิดปกติที่การแสดงออกของไทต์จังก์ชันและทำให้เกิดการตายของเซลล์แบบ necrosis ดังนั้นหากมีการปนเปื้อนเชื้อไวรัสพีอาร์อาร์เอสที่เยื่อบุมดลูกก็จะมีความเสี่ยงให้เกิดความเสียหายและนำไปสู่ความล้มเหลวในการสืบพันธุ์ได้"

Download

Share

COinS
 
 

To view the content in your browser, please download Adobe Reader or, alternately,
you may Download the file to your hard drive.

NOTE: The latest versions of Adobe Reader do not support viewing PDF files within Firefox on Mac OS and if you are using a modern (Intel) Mac, there is no official plugin for viewing PDF files within the browser window.