Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

การโคลนและผลิตคอลลาจีเนสของเชื้อเลปโตสไปราสำหรับการศึกษาความเป็นเอ็นไซม์และปฏิกิริยาอิมมูโน

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

Leptospira collagenase gene cloning and protein production for enzymatic activity and immunoreactivity study

Year (A.D.)

2015

Document Type

Thesis

First Advisor

จินตนา จิรถาวร

Faculty/College

Faculty of Medicine (คณะแพทยศาสตร์)

Degree Name

วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Degree Level

ปริญญาโท

Degree Discipline

วิทยาศาสตร์การแพทย์

DOI

10.58837/CHULA.THE.2015.614

Abstract

โรคเลปโตสไปโรซิสเกิดจากการติดเชื้อแบคทีเรียก่อโรคในจีนัสเลปโตสไปรา อาการของผู้ป่วยแสดงออกได้หลากหลาย บางรายอาจมีอาการรุนแรงเกี่ยวข้องกับอวัยวะหลายระบบและเสียชีวิตได้ กลไกการก่อโรคเลปโตสไปโรซิสยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด Ren และคณะ รายงานการศึกษาจีโนมของเชื้อเลปโตสไปราก่อโรคในปี ค.ศ. 2003 พบว่าเลปโตสไปรามีลำดับนิวคลีโอไทด์ LA0872 (colA gene) ที่น่าจะเป็นยีนสำหรับคอลลาจีเนส มีรายงานว่าคอลลาจีเนสเป็นเอ็นไซม์ที่พบว่ามีความสำคัญสำหรับเชื้อ Clostridium histolyticum และ Pseudomonas aeruginosa ในการก่อพยาธิสภาพ และพบการแสดงออกของยีน colA ในสัตว์ทดลองที่ได้รับเชื้อเลปโตสไปรา ผู้วิจัยจึงสนใจการโคลนยีนและเตรียมโปรตีน ColA และพบว่าเลปโตสไปราก่อโรคที่นำมาศึกษาทุก ซีโรวาร์มียีน colA จึงเลือกใช้ดีเอ็นเอของ Leptospira interrogans serovar Pyrogenes เป็นต้นแบบในการโคลนยีนและสร้างโปรตีน ColA โดยสามารถสร้างพลาสมิด pColA ที่นำมาใช้ในการผลิตโปรตีน ColA ได้ โปรตีน ColA ที่ผลิตได้สามารถทำปฏิกิริยากับซีรัมแฮมสเตอร์ที่ได้รับเชื้อเลปโตสไปราและซีรัมผู้ป่วยเลปโตสไปโรซิส แต่ไม่ทำปฏิกิริยากับซีรัมจากผู้ป่วยสครับไทฟัส ผู้ป่วยติดเชื้อไวรัสเดงกี่และซีรัมจากผู้บริจาคโลหิต จากผลการทดสอบที่ได้สรุปได้ว่าโปรตีน ColA มีความไวและความจำเพาะสำหรับใช้ในการตรวจหาแอนติบอดีต่อเลปโตสไปรา 100% และเมื่อทดสอบความเป็นเอ็นไซม์โดยทดสอบการย่อยคอลลาเจน พบว่าโปรตีน ColA ย่อยคอลลาเจนได้ และความสามารถในการย่อยคอลลาเจนถูกยับยั้งได้ด้วยสารยับยั้งคอลลาจีเนส การศึกษาในครั้งนี้สรุปได้ว่าสามารถโคลนยีนและสร้างพลาสมิด pColA ที่นำมาใช้ผลิตโปรตีน ColA ได้ ผลการทดสอบโปรตีน ColA ที่ได้พบว่ามีคุณสมบัติเป็นคอลลาจีเนสและทำปฏิกิริยากับซีรัมเลปโตสไปโรซิสได้ ซึ่งสนับสนุนว่าโปรตีนนี้น่าสนใจที่จะนำไปใช้ศึกษากลไกการก่อพยาธิสภาพและพัฒนาการทดสอบเพื่อช่วยวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซิส

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

Leptospirosis is caused by bacteria in genus Leptospira. Leptospirosis patients present with a wide range of clinical manifestations. Some patients develop severe symptoms involving multiple organs which can be fatal. Mechanisms underlying leptospirosis are not clearly understood. Leptospira whole genome reported by Ren et al in 2003 suggested that LA0872 (colA gene) contains the nucleotide sequence coding for a collagenase. Collagenases of other bacteria such as Clostridium histolyticum and Pseudomonas aeruginosae are involved in tissue damages. Leptospira colA gene was expressed in tissues of hamsters infected with Leptospira. In this study, colA gene and its gene product were investigated. All pathogenic Leptospira serovars tested in this study have colA gene. DNA from Leptospira interrogans serovar Pyrogenes was chosen for colA gene cloning. A plasmid containing colA gene (pColA) was constructed and ColA protein was produced. ColA protein could react with sera from Leptospira-infected hamsters and leptospirosis patients. However, sera from blood donors, patients with scrub typhus and dengue virus infection did not react with ColA protein. Data suggested that sensitivity and specificity of ColA protein for Leptospira antibody detection were 100%. ColA protein could hydrolyze collagen and its enzymatic activity was inhibited by a collagenase inhibitor. In conclusion, cloning and protein production of colA gene were done. ColA protein has enzymatic activity and immunogenicity. These suggest that ColA protein is an interesting Leptospira protein for further study of its role in pathogenesis and laboratory diagnosis.

Link to Full Text

Share

COinS