Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

การโคลนยีนจากเชื้อ Pseydomonas pseudomallei สู่ Escherichia coli และคัดเลือกโคลนที่แสดงคุณสมบัติสลายเม็ดเลือดแดง

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

Cloning of the genes from Pseudomonas pseudomallei and selection of hemolysin-expressing escherichia coli

Year (A.D.)

1993

Document Type

Thesis

First Advisor

สมหญิง ธัมวาสร

Faculty/College

Graduate School (บัณฑิตวิทยาลัย)

Degree Name

วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Degree Level

ปริญญาโท

Degree Discipline

จุลชีววิทยาทางการแพทย์

DOI

10.58837/CHULA.THE.1993.601

Abstract

Pseudomonas pseudomallei เป็นแบคทีเรียแกรมลบที่เป็นสาเหตุของโรค melioidosis คุณสมบัติที่คาดว่าน่าจะมีบทบาทในการก่อโรค ได้แก่ surface antigens และ extracellular substances พวก exotoxin, protease และ hemolysin เพื่อที่จะศึกษา hemolysin ของ P.pseudomallei ได้ใช้ recombinant DNA technique โคลนดีเอ็นเอของ P. pseudomallei สายพันธุ์ K1/88 เข้าสู่ E. coli JM 109 โดยตัดดีเอ็นเอของ P.pseudomallei ด้วย PstI อย่างไม่สมบูรณ์แล้วนำมา ligate กับพลาสมิด pUC18 ซึ่งถูกตัดด้วย PstI และถูก dephosphorylated จากนั้น transform ligation mixture สู่ competent E. coli JM 109 แล้วเพาะเลี้ยงบน amplicillin agar ที่มี X-gal เลือกโคโลนีสีขาว ซึ่งเป็นโคโลนีของ transformants ที่มี recombinant plasmids นำ transformants ไปทดสอบหา hemolytic activity ด้วย cellophane plate technique พบ transformants ที่ให้ hemolytic activity 3 โคลน ซึ่งมี recombinant plasmids ที่ให้ชื่อว่า pWC3, pWC7 และ pWD1 โดยมี inserted DNA ขนาดประมาณ 0.9, 0.9 และ 5.6 kb ตามลำดับ เมื่อใช้ inserted DNA ทั้งสามเป็น probe ในการไฮบริไดซ์กับ Southern blots พบว่า inserted DNA สามารถไฮบริไดซ์กับ Chromosomal DNA fragment ของ P. pseudomallei ที่ตัดด้วย PstI ที่ตำแหน่งเดียวกัน inserted DNAยกเว้นกรณี inserted DNA fragment ขนาด 400 bp ของ pWC7 ที่ไฮบริไดซ์เป็น smear กับ DNA ที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูง นอกจากนี้ยังพบว่า inserted DNA ของทั้ง 3 โคลน ไม่มี homology กัน

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

Pseudomonas pseudomallei is a gram-negative bacterium which is the causative agent of melioidosis. Properties which are implicated to contribute virulence to this bacterium are surface antigens, and extracellular substances such as exotoxin, protease and hemolysin. In order to study the the hemolysin of P. pseudomallei, recombinant DNA techniques were employed to clone P. pseudomallei DNA into E. coli JM 109 via pUC13 cloning vector. Chromosomal DNA was partially digested with PstI restriction endonuclease and ligated with the dephosphorylated PstI site of pUC18 DNA. The ligation mixture was transformed into competent E. coli. Trans formants were selected on ampicillin agar containing X-gal. These trans formants were screened for the hemolytic activity by the cellophane plate technique. It was found that three E. coli transformants possessed hemolytic activity. These trans formants harbored recombinant plasmids pWC3, pWC7 and pWD1 of which the inserts are approximately 0.9, 0.9 and 5.6 kb respectively. Southern blot analysis using these inserted DNA as probe demonstrated that P. pseudomallei DNA fragments of the same size with the probe hybridized to each probe except the 0.4 kb fragment of pWC7 which hybridized to higher molecular weight DNA of PstI digested P. pseudomallei. chromosomal DNA fragments. In addition, there was no homology among these inserted DNA.

Link to Full Text

Share

COinS