Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

Construction of appropiate DNA probes of Plasmodium falciparum for detection of infected mosquitoes

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

การสร้างดีเอ็นเอตรวจสอบที่มีประสิทธิภาพของเชื้อมาเลเรีย (Plasmodium falciparum) เพื่อตรวจหาเชื้อในยุงก้นปล่อง ที่ได้รับเชื้อ

Year (A.D.)

1997

Document Type

Thesis

First Advisor

Prapon Wilairat

Second Advisor

Mukda Nudasomboon

Faculty/College

Graduate School (บัณฑิตวิทยาลัย)

Degree Name

Master of Science

Degree Level

Master's Degree

Degree Discipline

Botany

DOI

10.58837/CHULA.THE.1997.1155

Abstract

DNA from Plasmodium falciparum, Thai isolate K1, was purified and fragmented using restriction endonuclease EcoRI*. These DNA fragments were inserted into pUN21 at the EcoRI site and cloned in E. coli strain JM 107. A library containing 20,000 tetracycline-resistant transformants were obtained. Using colony hybridization technique, 53 recombinant DNA clones were selected. From Southern hybridization of 53 recombinant plasmids, pUNK1-32, -34, -43, -45, -51 were selected. The two sensitive recombinant DNA probes. pUNK1-34 and pUNK1-45, were able to detect a parasitemia of at least 0.005% in 20 μl of infected blood. pUNK1-45 did not cross-hybridize with DNA from other plasmodial species, eg. P. chabaudi, P. knowlesi and P. cynomolgi nor with man and mosquito. The plasmid pUNK1-34 did not cross-hybridize with other DNA except from P. chabaudi, Using pUNK1-45 as probe, oocysts and sporozoites could be detected in only one or less infected mosquito. The probe was able to detect at least 5000-1000 sporozoites. Studies of restriction map and organization of the DNA inserts of pUNK1-34 and pUNK1-45 in genome of P.falciparum showed that the two fragments were not homologous. The estimated copy number of pUNK 1-34 and pUNK1-45 in the genome of P. falciparum was about 25 and 120.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

ได้ทำการโคลนนิ่ง (Cloning) ของเชื้อมาเลเรีย Plasmodium falciparum โดยสกัดดีเอ็นเอจากเชื้อ P.falciparum สายพันธุ์ Kl ที่พบในประเทศไทย และตัดดีเอ็นเอด้วยเอ็นไซม์ EcoRI* นำไปเชื่อมต่อกับดีเอ็นเอ พาหะได้แก่ พลาสมิด pUN 121 ที่ตำแหน่งของเอ็นไซม์ EcoRI คัดเลือก transformants โดยใช้อาหารเลี้ยงเชื้อที่มียาปฏิชีวนะเตตราไซคลินได้ 20,000 clones และในจำนวนนี้ได้คัดเลือก recombinant clones ที่มีดีเอ็นเอที่ซ้ำๆ กันได้ 53 clones โดยใช้วิธี colony hybridization pUNK1-32, -34, -43, -45 และ 51 คือพลาสมิดที่คัดได้จากวิธี Southern hybridization และ pUNK1-34, pUNK1-45 เป็น recombinants ที่มีความไวต่อการตรวจ DNA ของ P. falciparum ในปริมาณ 0.005 ตัว ต่อเม็ดเลือดแดง 100 เซลล์ (0.005% parasitemia) จากเลือด 20 ไมโครลิตร นอกจากนี้ pUNK1-45 ยังไม่จับกับดีเอ็นเอของคน, ยุงพาหะ หรือเชื้อมาลาเรียชนิดอื่น เช่น P. chabaudi, P. knowlesi, P. cynomolgi, P. vivar พลาสมิด pUNK1-34 ไม่จับกับดีเอ็นเอของคน ยุงพาหะ และเชื้อมาลาเรียชนิดอื่นยกเว้น P. chabaudi เมื่อใช้ pUNK1-45 ตรวจหาเชื้อ P.falciparum ระยะ oocyst และ sporozoite ในยุงพาหะ พบว่า pUNK1-45 สามารถตรวจหาเชื้อได้ในยุงเพียงตัวเดียวหรือน้อยกว่านั้น และจำนวน sporozoite น้อยที่สุดสามารถตรวจพบได้คือ 5,000-1,000 ตัว จากการศึกษา restriction map ของพลาสมิด pUNK1-34 และ pUNK1-45 และศึกษาการกระจายของชั้นดีเอ็นเอของพลาสิค pUNK1-34 และ pUNK1-45 ใน genome ของ P.falciparum พบว่าชิ้นดีเอ็นเอทั้ง 2 น่าจะมีลำดับนิวคลิโอไทด์แตกต่างกัน ซึ่งสามารถคำนวณได้ว่าชิ้นดีเอ็นเอของ pUNK1-34 มีจำนวน 25 ชุดบน genome ของ P.falciparum และชิ้นดีเอ็นเอของ pUNK1-45 มีจำนวน 120 ชุด

Link to Full Text

Share

COinS