Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

การวิเคราะห์ไมโครไบโอตาในน้ำเชื้อสุกรที่สัมพันธ์กับคุณภาพอสุจิภายใต้การเก็บรักษาในสารละลายน้ำเชื้อที่มีเจนตาไมซิน

Year (A.D.)

2022

Document Type

Thesis

First Advisor

Padet Tummaruk

Second Advisor

Nuvee Prapasarakul

Faculty/College

Faculty of Veterinary Science (คณะสัตวแพทยศาสตร์)

Department (if any)

Department of Obstetrics, Gynaecology & Reproduction (ภาควิชาสูติศาสตร์-เธนุเวชวิทยาและวิทยาการสืบพันธุ์)

Degree Name

Master of Science

Degree Level

Master's Degree

Degree Discipline

Theriogenology

DOI

10.58837/CHULA.THE.2022.1285

Abstract

The present study was carried out to (i) investigate the association between boar semen microbiota and semen qualities and (ii) determine the relationship between boar bacteria contamination and longevity of boar semen preserved for 3 days in BTS with and without gentamicin. A total of 20 Duroc ejaculates were collected from standard quality boars (n=10) and high-quality ones (n= 10). Besides 3 ml of fresh semen of each ejaculate was subjected to 16S rRNA gene sequencing and bioinformatics including alpha diversity, beta diversity, and taxonomic mapping, each ejaculate was diluted in two conditions of Beltsvile Thawing Solution (BTS) extender: CONTROL: semen was diluted in BTS without gentamicin and TREATMENT: the semen was diluted in BTS supplemented with 0.25 g/l of gentamicin to produce doses of semen containing 3 billion of spermatozoa in 100 ml. During 3 storage days, the sperm motility, sperm viability, acrosome integrity, sperm membrane permeability, mitochondrial activity, and total aerobic bacteria count was evaluated. Semen microbiota analysis indicated that Lactobacillales (25.2 %), Enterobacterales (10.3 %) and Bacteroidales (9.3 %) were the most dominant bacteria. While 88.3 % of standard quality semen clustered into the top 25% of lowest Lactobacilales, 100% of high-quality samples clustered in the third quartile. Although no differences in the diversity in microbiota composition were detected across semen quality samples (P > 0.05), the negative linear relationship between Lactobacillales and Enterobacterales: y = 507.3 - 0.5x, R2 = 0.24 (P < 0.001), the differences in the abundance of lesser dominant bacteria and the correlation among them were detected (P < 0.05). Bacterial culture and semen evaluation revealed that along with a higher sperm viability detected in high quality samples compared to standard quality ones (83.8 ± 1.5 % versus 69.4 ± 1.5 %, respectively, P < 0.001) was the lower total bacteria count (CFU/ ml, log10) (3.7 ± 0.2 log versus 4.4 ± 0.2 log, respectively, P = 0.019) and a negative linear relationship established: y = 102. 8 – 6.4x, R2 = 0.25 (P = 0.026). All ejaculates were contaminated with three to ten bacterial types belonging to Enterobacteriaceae Pseudomonadaceae, Pasteurellaceae family. While Staphylococcus spp. (20.5 %), Micrococcus spp. (12.6 %), and Escherichia coli (11.7 %) accounted for the highest percentage, the lower percentage ones such as Klebsiella oxytoca (3.1 %), Acinetobacter spp. (0.9 %) and Bachybacterium conlomeratum (0.2 %) were also isolated. There were no differences in Staphylococcus spp. count and Proteus spp. count compared between standard and high-quality ejaculates (P < 0.05) although these were most frequently isolated. Under the bacteriostatic activity of the antibiotic, the total CFU/ml in the diluted semen with antibiotic was lower than in the diluted one without antibiotic and fresh semen (2.0 versus 2.9 and 4.0 log, respectively, P < 0.001). The total bacterial count in the TREATMENT group was lower than in the CONTROL group (1.9 ± 0.1 versus 3.9 ± 0.1 respectively, P < 0.001) on each day of preservation (P< 0.001). In CONTROL group, the total CFU/ ml, log10 on day 2 (4.3 log) and day 3 (5.3 log) was higher than on day 0 (2.9 log) and day 1 (3.2 log) (P < 0.001), but no significant differences was detected in TREATMENT group (P > 0. 05). Generally, although no significant difference regarding sperm plasma membrane permeability and mitochondrial activity was detected (P > 0.05), the sperm motility, viability and acrosome integrity in the TREATMENT group were higher than those in the CONTROL group (P < 0.05) during preservation time across boar ejaculates. While all measured sperm parameters in the TREATMENT group were higher than those in the CONTROL group (P < 0.001) examined on high-quality samples, only sperm mitochondrial activity in the CONTROL group was higher than TREATMENT group (60.2 ± 3.1% versus 58.7 ± 3.1%, respectively, P < 0.05) examined on standard quality samples. On days 1, 2 and 3 of storage, no differences between the CONTROL and TREATMENT groups were detected among standard quality samples (P > 0.05). However, the significant differences were registered on Day 2 and Day 3 between the CONTROL and TREATMENT groups across high-quality samples (P > 0.05). In conclusion, porcine semen microbiota analysis can be used to access the semen quality and adding the current antibiotic dose significantly controlled the bacteria contamination in stored semen as well as can improve the semen qualities collected from high-quality boars but not standard quality ones during preservation time.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

การศึกษาวิจัยครั้งนี้จัดทำขึ้นเพื่อ (i) ศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างเชื้อจุลินทรีย์ในน้ำเชื้อพ่อสุกรและคุณภาพของน้ำเชื้อ และ (ii) ศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างเชื้อแบคทีเรียที่ปนเปื้อนในน้ำเชื้อพ่อสุกร และอายุการเก็บรักษาน้ำเชื้อพ่อสุกรเป็นระยะเวลา 3 วัน ในสารละลายบีทีเอสที่มีและไม่มียาปฏิชีวนะเจนตามัยซิน น้ำเชื้อพ่อสุกรพันธุ์ดูร็อคทั้งหมด 20 ตัวอย่าง ถูกรีดเก็บจากพ่อสุกรที่มีคุณภาพน้ำเชื้อดีในระดับมาตรฐาน (n=10) และ น้ำเชื้อที่มีคุณภาพดีมาก (n=10) นอกจากนี้ น้ำเชื้อพ่อสุกรสดปริมาตร 3 มิลลิลิตร จากแต่ละตัวอย่างถูกนำมาตรวจลำดับยีนส์ด้วย 16S rRNA และ ไบโออินฟอร์เมติกซ์ ประกอบด้วย alpha diversity, beta diversity และ taxonomic mapping ในแต่ละตัวอย่างน้ำเชื้อ ถูกเจือจางด้วยสารละลายน้ำเชื้อ 2 ชนิด ได้แก่ กลุ่มควบคุม น้ำเชื้อถูกละลายด้วยสารละลาย Beltsvile Thawing Solution (BTS) โดยไม่มียาปฏิชีวนะชนิดเจนต้ามัยซิน และกลุ่มทดลอง น้ำเชื้อถูกละลายด้วยสารละลายBTSที่มียาปฏิชีวนะชนิดเจนต้ามัยซินในปริมาณ 0.25 กรัม/ลิตร ในแต่ละโด๊สของน้ำเชื้อประกอบด้วย น้ำเชื้อที่มีจำนวนเซลล์อสุจิจำนวน 3 พันล้านตัวในปริมาตร 100 มิลลิลิตร ระหว่าง 3 วันของการเก็บรักษา เปอร์เซ็นต์การเคลื่อนที่ของเซลล์อสุจิ สัดส่วนของเซลล์อสุจิที่มีชีวิต ความสมบูรณ์ของอะโครโซม ความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์อสุจิ การตอบสนองของไมโตคอนเดรีย และ จำนวนเชื้อแบคทีเรียชนิดที่ใช้ออกซิเจนที่นับได้ ถูกวิเคราะห์ ผลการวิเคราะห์เชื้อจุลินทรีย์ในน้ำเชื้อพบว่าเชื้อแบคทีเรียชนิด Lactobacillales (25.2%) Enterobacterales (10.3%) และ Bacteroidales (9.3%) เป็นเชื้อที่ถูกพบได้มากที่สุด ในขณะที่ 88.3% ของน้ำเชื้อที่มีคุณภาพมาตรฐาน จัดอยู่ในกลุ่ม 25% แรก ที่มีเชื้อแบคทีเรียชนิด Lactobacilales ในปริมาณต่ำ 100% ของตัวอย่างน้ำเชื้อที่มีคุณภาพดีมาก ถูกจัดอยู่ในกลุ่มควอไทล์ที่ 3 ถึงแม้ว่าจะไม่มีความแตกต่างในด้านความแปรปรวนของเชื้อจุลินทรีย์ถูกพบระหว่างกลุ่มของน้ำเชื้อที่มีคุณภาพต่างกัน (P > 0.05) พบสหสัมพันธ์เชิงลบระหว่างเชื้อแบคทีเรียชนิด Lactobacillales และ Enterobacterales: y = 507.3 - 0.5x, R2 = 0.24 (P < 0.001)ความแตกต่าง ในปริมาณของเชื้อแบคทีเรียของเชื้อที่พบได้น้อยกว่า และสหสัมพันธ์ระหว่างเชื้อแบคทีเรียเหล่านี้ก็ตรวจพบได้ (P < 0.05) การเพาะเชื้อแบคทีเรีย และการตรวจคุณภาพน้ำเชื้อพ่อสุกรแสดงให้เห็นว่าน้ำเชื้อพ่อสุกรที่มีสัดส่วนของอสุจิที่มีชีวิตจำนวนมาก ถูกพบมากกว่าในตัวอย่างของน้ำเชื้อที่มีคุณภาพดีมาก เมื่อเปรียบเทียบกับน้ำเชื้อที่มีคุณภาพในระดับมาตรฐาน (83.8 ± 1.5 % กับ 69.4 ± 1.5 % ตามลำดับ P < 0.001) ซึ่งมีจำนวนเชื้อแบคทีเรียทั้งหมดต่ำกว่า (CFU/ ml, log10) (3.7 ± 0.2 log กับ 4.4 ± 0.2 log ตามลำดับ P = 0.019 และมีความสัมพันธุ์เชิงลบต่อกันดังสมการ y = 102. 8 – 6.4x, R2 = 0.25 (P = 0.026) ตัวอย่างน้ำเชื้อทั้งหมดมีการปนเปื้อน 3 ถึง 10 ชนิด ของเชื้อแบคทีเรีย ในกลุ่ม Enterobacteriaceae Pseudomonadaceae และ Pasteurellaceae ในขณะที่ Staphylococcus spp. (20.5 %) Micrococcus spp. (12.6 %) และ Escherichia coli (11.7 %) ตรวจพบในสัดส่วนที่สูงที่สุด ในกลุ่มที่พบในสัดส่วนที่ต่ำ เช่น Klebsiella oxytoca (3.1 %) Acinetobacter spp. (0.9 %) และ Bachybacterium conlomeratum (0.2 %) ก็ถูกแยกได้เช่นเดียวกัน ไม่มีความแตกต่างของจำนวน Staphylococcus spp. และ Proteus spp. เปรียบเทียบระหว่างน้ำเชื้อที่มีคุณภาพมาตรฐานและน้ำเชื้อคุณภาพดี (P < 0.05) ถึงแม้ว่าเชื้อเหล่านี้จะถูกแยกได้มากที่สุด ภายใต้ผลของการยับยั้งเชื้อแบคทีเรียของยาปฏิชีวนะ ปริมาณเชื้อแบคทีเรียทั้งหมด CFU/ml ในน้ำเชื้อพ่อสุกรที่เจือจางที่มียาปฏิชีวนะต่ำกว่าน้ำเชื้อพ่อสุกรที่ไม่มียาปฏิชีวนะ และน้ำเชื้อสด (2.0 กับ 2.9 และ 4.0 log ตามลำดับ P < 0.001) จำนวนเชื้อแบคทีเรียที่นับได้ทั้งหมดในกลุ่มทดลองต่ำกว่ากลุ่มควบคุม (1.9 ± 0.1 กับ 3.9 ± 0.1 ตามลำดับ P < 0.001) ในแต่ละวันของการเก็บรักษา (P< 0.001) ในกลุ่มควบคุม จำนวนเชื้อแบคทีเรียทั้งหมด CFU/ ml, log10 ในวันที่ 2 (4.3 log) และวันที่ 3 (5.3 log) สูงกว่าในวันที่ 0 (2.9 log) และวันที่ 1 (3.2 log) (P < 0.001) แต่ไม่มีความแตกต่างในกลุ่มทดลอง (P > 0. 05) โดยทั่วไป ถึงแม้ว่าจะไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญเกี่ยวกับเยื่อหุ้มเซลล์ของอสุจิ และ การทำงานของไมโตคอนเดรีย (P > 0.05) เปอร์เซ็นต์การเคลื่อนที่ของอสุจิ สัดส่วนของอสุจิที่รอดชีวิต และความสมบูรณ์ของอะโครโซม ในกลุ่มทดลองสูงกว่ากลุ่มควบคุม (P < 0.05) ในช่วงระหว่างการเก็บรักษาในน้ำเชื้อพ่อสุกรทั้ง 2 กลุ่ม ในขณะที่พารามิเตอร์ต่างๆของเซลล์อสุจิในกลุ่มทดลองสูงกว่ากลุ่มควบคุม (P < 0.001) ในน้ำเชื้อที่มีคุณภาพดีมาก มีเพียงการทำงานของไมโตคอนเดรียในกลุ่มควบคุมที่สูงกว่ากลุ่มทดลอง (60.2 ± 3.1% กับ 58.7 ± 3.1% ตามลำดับ P < 0.05) ในน้ำเชื้อที่มีคุณภาพมาตรฐาน ในวันที่ 1 2 และ 3 ของการเก็บรักษา ไม่พบความแตกต่างระหว่างกลุ่มควบคุมและกลุ่มทดลองในน้ำเชื้อที่มีคุณภาพมาตรฐาน (P > 0.05) อย่างไรก็ดี พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในวันที่ 2 และ 3 ระหว่างกลุ่มควบคุมและกลุ่มทดลองในน้ำเชื้อที่มีคุณภาพสูง (P > 0.05) โดยสรุป การวิเคราะห์เชื้อจุลินทรีย์ในน้ำเชื้อพ่อสุกรสามารถใช้เพื่อประเมินคุณภาพน้ำเชื้อพ่อสุกร และการเติมยาปฏิชีวนะในน้ำเชื้อพ่อสุกรสามารถควบคุมปริมาณเชื้อแบคทีเรียที่ปนเปื้อนในน้ำเชื้อระหว่างการเก็บรักษาได้อย่างมีนัยสำคัญ และสามารถเพิ่มคุณภาพของน้ำเชื้อพ่อสุกรที่รีดเก็บได้จากพ่อสุกรที่มีคุณภาพของน้ำเชื้อดี แต่ไม่ช่วยในน้ำเชื้อพ่อสุกรที่มีคุณภาพมาตรฐานระหว่างการเก็บรักษา

Download

Share

COinS
 
 

To view the content in your browser, please download Adobe Reader or, alternately,
you may Download the file to your hard drive.

NOTE: The latest versions of Adobe Reader do not support viewing PDF files within Firefox on Mac OS and if you are using a modern (Intel) Mac, there is no official plugin for viewing PDF files within the browser window.