Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
The effect of phytochemicals (flavonoids and naphthoquinones) in combination with smac mimetic on immunogenic cell death induction in cholangiocarcinoma cells
Year (A.D.)
2022
Document Type
Thesis
First Advisor
ศิริพร จิตแก้ว
Faculty/College
Faculty of Allied Health Sciences (คณะสหเวชศาสตร์)
Department (if any)
Department of Clinical Chemistry (ภาควิชาเคมีคลินิก)
Degree Name
วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต
Degree Level
ปริญญาโท
Degree Discipline
ชีวเคมีคลินิกและอณูทางการแพทย์
DOI
10.58837/CHULA.THE.2022.1293
Abstract
มะเร็งท่อน้ำดีเป็นมะเร็งที่เกิดขึ้นบริเวณท่อทางเดินน้ำดี โดยมีความหลากหลายของเซลล์มะเร็งบริเวณเนื้อเยื่อมะเร็งและมีความรุนแรง มะเร็งท่อน้ำดีจัดเป็นสาเหตุหลักในการเสียชีวิตของผู้ป่วยในประเทศไทย เนื่องจากผู้ป่วยได้รับการวินิจฉัยเมื่อมะเร็งเจริญพัฒนาไปยังระยะท้ายและยังขาดวิธีการรักษาที่มีประสิทธิภาพ การรักษามะเร็งท่อน้ำดีด้วยวิธีมาตรฐานในปัจจุบันในผู้ป่วยที่ไม่สามารถผ่าตัดได้ หรือในผู้ป่วยหลังการผ่าตัด คือ การรักษาด้วยยาเคมีบำบัด ชนิดเจมไซทาบีนหรือยาเจมไซทาบีนร่วมกับยาซิสพลาติน แต่อย่างไรก็ตามผู้ป่วยส่วนใหญ่พบปัญหาการดื้อต่อยาเคมีบำบัดนำไปสู่การพยากรณ์โรคที่ไม่ดี ดังนั้นการพัฒนาการรักษาที่มีประสิทธิภาพมากยิ่งขึ้นถือว่ามีความจำเป็นเร่งด่วน โดยได้มีการศึกษาการตายของเซลล์มะเร็งแบบใหม่ที่ทำให้เซลล์มะเร็งตาย และกระตุ้นการทำงานของระบบภูมิคุ้มกันแบบจำเพาะ เรียกว่า การตายของเซลล์ที่กระตุ้นภูมิคุ้มกัน โดยการตายของเซลล์แบบเนคโครปโทซิส จัดว่าเป็นการตายของเซลล์ที่กระตุ้นภูมิคุ้มกัน โดยได้มีการศึกษาอย่างแพร่หลายในมะเร็งหลายชนิด โดยพบว่าการกระตุ้นให้เซลล์มะเร็งตายแบบเนคโครปโทซิสสามารถกระตุ้นระบบภูมิคุ้มแบบจำเพาะและยับยั้งการเจริญพัฒนาของก้อนมะเร็งในหนูทดลอง การศึกษาภายในห้องปฏิบัติการก่อนหน้าของคณะผู้วิจัยพบว่าการเหนี่ยวนำร่วมกันระหว่างยาเคมีบำบัดเจมไซทาบีนและสารสะแมคไมเมติกสามารถเหนี่ยวนำให้เซลล์มะเร็งท่อน้ำดีตายแบบเนคโครปโทซิสในสภาวะที่มีการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์แคสเปส ทั้งนี้จากข้อจำกัดที่ยาเคมีบำบัดมีความเป็นพิษที่สูง การศึกษานี้จึงมีจุดมุ่งหมายเพื่อค้นหาสารที่สามารถนำมาทำการเหนี่ยวนำร่วมกับสารสะแมคไมเมติก โดยมีสมมติฐานของงานวิจัย คือ สารพฤกษเคมีที่มีฤทธิ์ทำให้เกิดการทำลายของดีเอ็นเอและหยุดวัฏจักรของเซลล์จะสามารถเสริมฤทธิ์กับสารสะแมคไมเมติก โดยกระตุ้นการตายของเซลล์แบบในคโครปโทซิสในเซลล์มะเร็งท่อน้ำดี โดยงานวิจัยนี้ได้ทำการศึกษาฤทธิ์ยับยั้งการแบ่งตัวและการตายเซลล์มะเร็งท่อน้ำดีของสารพฤกษเคมี ได้แก่ ชิโคนิน พลัมบาจิน เควอซิติน โดยพบว่าสารเควอซิตินมีค่าความเข้มข้นของสารที่ยับยั้งการรอดชีวิตของเซลล์ได้ 50% (IC50) ที่ต่ำที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับสารพฤกษเคมีชนิดอื่นๆ ในการวิเคราะห์ด้วยวิธีการทางชีวสารสนเทศน์พบว่าสารเควอซิตินมีเป้าหมายไปยังยีนที่มีบทบาทในการควบคุมวัฏจักรเซลล์ระยะ G2/M และยีนเป้าหมายของสารเควอซิตินมีการแสดงออกที่เพิ่มมากขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเนื้อเยื่อมะเร็งท่อน้ำดีเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ปกติ การทดลองในเซลล์มะเร็งท่อน้ำดี (in vitro) พบว่าสารเควอซิตินสามารถหยุดวัฏจักรเซลล์ที่ระยะ G2/M นอกจากนี้สารเควอซิตินช่วงความเข้มข้นค่าต่ำที่มีความเป็นพิษน้อยในรูปแบบสารเดี่ยว เมื่อนำไปเหนี่ยวนำร่วมกับสารสะแมคไมเมติกชนิด LCL-161 แล้วพบว่าสามารถเสริมฤทธิ์กันกระตุ้นการตายของเซลล์มะเร็งท่อน้ำดี โดยเมื่อทำการวิเคราะห์ชนิดการตายของเซลล์เพิ่มเติมพบว่ามีการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของโปรตีนเอ็มแอลเคแอลที่ถูกเติมหมู่ฟอสเฟต (phosphorylated MLKL; pMLKL) ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ที่จำเพาะต่อการตายแบบเนคโครปโทซิส นอกจากนั้นยังพบว่าการตายของเซลล์ถูกยับยั้งเมื่อมีการเติมตัวยับยั้งที่จำเพาะกับโปรตีนที่สำคัญต่อการเกิดเนคโครปโทซิส แสดงให้เห็นว่าการเหนี่ยวนำเซลล์ด้วยสารเควอซิตินร่วมกับสารสะแมคไมเมติกสามารถกระตุ้นให้เซลล์มะเร็งท่อน้ำดีตายผ่านเนคโครปโทซิส การศึกษาเพิ่มเติมเพื่อศึกษาการตายของเซลล์ที่กระตุ้นภูมิคุ้มกัน โดยการวิเคราะห์การเคลื่อนย้ายของโปรตีนเอชเอ็มจีบีวัน (HMGB-1) จากภายในนิวเคลียสมายังบริเวณไซโตพลาสซึมด้วยวิธีการย้อมแบบอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ พบว่าการเหนี่ยวนำเซลล์มะเร็งท่อน้ำดีด้วยสารเควอซิตินร่วมกับสารสะแมคไมเมติกสามารถกระตุ้นการตายของเซลล์ที่กระตุ้นภูมิคุ้ม กล่าวโดยสรุป การเหนี่ยวนำร่วมกันระหว่างสารเควอซิตินและสารสะแมคไมเมติกในสภาวะที่มีการยับยั้งเอนไซม์แคสเปสสามารถเสริมฤทธิ์กันโดยกระตุ้นการตายของเซลล์มะเร็งท่อน้ำดีแบบเนคโครปโทซิสและการตายของเซลล์ที่กระตุ้นภูมิคุ้มกัน ดังนั้นงานวิจัยนี้อาจนำไปสู่การพัฒนากลยุทธ์การรักษามะเร็งท่อน้ำดีแบบใหม่ที่เพิ่มประสิทธิภาพในการรรักษาในอนาคต อย่างไรก็ตาม งานวิจัยนี้ยังต้องมีการศึกษาเพิ่มเติม เช่น การศึกษากลไกการเสริมฤทธิ์และการกระตุ้นการตายของเซลล์ การศึกษาฤทธิ์ในเซลล์มะเร็งท่อน้ำดีชนิดอื่นๆ และการเมินความเป็นพิษในเซลล์ปกติ เป็นต้น
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
Cholangiocarcinoma (CCA) is a heterogenous and aggressive form of cancer originated in bile duct. CCA is the leading cause of mortality in Thailand due to late diagnosis and lack of effective therapy. Standard treatment is based on chemotherapy including gemcitabine or gemcitabine combined with cisplatin, however most of patients develop chemoresistance resulting in poor prognosis. Therefore, more effective cancer therapy is urgently required. Cell death with dual benefits which are cancer cell killing and activation of adaptive immune system has been identified as immunogenic cell death (ICD). Necroptosis is considered as a form of ICD which has been suggested as a potential cancer treatment. Our previous study showed that the combination treatment between gemcitabine and smac mimetic when caspases were inhibited induced necroptosis in CCA cells. Due to high toxicity of chemotherapy, in this study we aimed to identify natural compounds with could be combined with smac mimetic. We hypothesized that natural compounds that can cause DNA damage and cell cycle arrest could synergize with smac mimetic to induce necroptosis in CCA cells. To this end, shikonin, plumbagin, quercetin and kaempferol were analyzed in this study. To study the effects of natural compounds on CCA cell survival and inhibition of cell proliferation, we demonstrated that quercetin had the lowest half-maximal inhibitory concentration (IC50) in CCA cells among natural compounds tested. In silico analysis suggested that quercetin could target key cell cycle-regulated genes in G2/M phase and those target genes of quercetin were significantly overexpressed in CCA compared to normal tissues. In vitro study further confirmed that quercetin arrested cell cycle at G2/M phase. In addition, the combination of the low doses of quercetin with a minimum toxicity as a single agent could synergize with smac mimetic, LCL-161 to induce cell death in CCA cells. To further specified the type of cell death, the combination treatment between quercetin and smac mimetic induced an increase of phosphorylated MLKL (pMLKL), a specific marker of necroptosis and the cell death was inhibited by inhibitors of key necroptotic proteins which suggest the cell death is necroptosis. Moreover, the combination treatment caused the translocation of HMGB-1 from nucleus to cytoplasm, a surrogate marker of ICD as evaluated by Immunofluorescence staining. Taken together, our study suggests that quercetin could synergize with smac mimetic to induce necroptosis and immunogenic cell death (ICD) when caspases were inhibited in CCA cells which could lead to develop a novel treatment strategy for CCA patients. Finally, mechanistic studies, analysis in other CCA cell lines and evaluation of toxicity in normal cells are required for further investigation.
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
ใจกล้า, ภัทธร, "ฤทธิ์การเหนี่ยวนำร่วมระหว่างสารพฤกษเคมีกลุ่มฟลาโวนอยด์และแนพโทควิโนนกับสารสะแมคไมเมติกต่อการตายของเซลล์มะเร็งที่กระตุ้นภูมิคุ้มกันในเซลล์มะเร็งท่อน้ำดี" (2022). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 12483.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/12483