Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)
Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)
โปรตีนเอพิเดอร์มัลโกรทแฟคเตอร์มนุษย์ที่ปลดปล่อยจากแพลตฟอร์มของกรดไฮยาลูโรนิกต่อการเพิ่มจำนวนของเซลล์ต่อมน้้าลายเพาะเลี้ยง
Year (A.D.)
2022
Document Type
Thesis
First Advisor
Joao Nuno Andrade Requicha Ferreira
Second Advisor
Supansa Yodmuang
Faculty/College
Faculty of Dentistry (คณะทันตแพทยศาสตร์)
Degree Name
Master of Science
Degree Level
Master's Degree
Degree Discipline
Oral Biology
DOI
10.58837/CHULA.THE.2022.1150
Abstract
Off-the-shelf recombinant growth factors are increasingly used as signaling cues to optimize organoid biofabrication and shorten the in vitro culture time. These factors are mainly produced in prokaryotic systems but lack post-translational modifications. To overcome such limitations and the high production costs related to these common systems, plant molecular farming is a novel, easy adaptable and feasible alternative. Epidermal growth factor (EGF) is a known signaling cue essential for epithelial organogenesis and organoid biofabrication particularly in exocrine glands. This study aims to develop an EGF delivery in vitro platform with Nicotiana benthamiana plant-derived EGF (P-EGF) encapsulated on hyaluronic acid/alginate (HA/Alg) hydrogels to improve the efficacy of glandular epithelial organoid biofabrication in short-term culture systems. Primary epithelial cells derived from submandibular gland porcine biopsies were characterized through culture passages 1-7 and treated with a range of concentrations (5 – 20 ng/mL) of bacteria-derived EGF (B-EGF) and P-EGF. Cell proliferation was measured by MTT and luciferase-based ATP assays. Next, HA and Alg components were chemically assembled using different volume ratios to determine the optimal one to delay hydrogel hydrolytic degradation and to support the sustained release of P-EGF and other model proteins. Epithelial organoids fabricated from P-EGF-encapsulated HA/Alg hydrogel were characterized by cell viability, ATP-based, quantitative polymerase chain reaction, immunofluorescence-based cytometry, whole-mount immunohistochemistry, and functional assays. B-EGF and P-EGF 5 – 20 ng/mL promoted glandular epithelial cell proliferation during 6 culture days on a comparable fashion. Volume ratio 5:4:1 of HA/Alg/P-EGF hydrogel was optimal to fabricate a sustainable P-EGF delivery system for short-term culture since this system released approximately 85.8% of P-EGF within 3 days. P-EGF-encapsulated hydrogel enhanced organoid forming efficiency and cell proliferation compared to P-EGF-supplemented media. Moreover, epithelial organoids developed from P-EGF-encapsulated HA/Alg platforms expressed specific glandular epithelial markers such as acinar (AQP5, AQP1, NKCC1, Mist1), ductal (K18, Krt19), progenitor (K14, K5), and myoepithelial (α-SMA). There was a major enrichment of the secretory acinar compartment in the epithelial organoids followed by the ductal one at the transcriptome level. These organoids also responded to cholinergic neurostimulation with an enhanced calcium influx and α-amylase secretion. Thus, the utilization of Nicotiana benthamiana in molecular farming can produce EGF biologicals amenable for encapsulation in HA/Alg-based in vitro platforms to promptly induce the biofabrication of glandular epithelial organoids with secretory functions in short-term culture strategies. These plant biotechnology in vitro platforms have potential to generate patient-derived organoids mimicking exocrine glands for applications in drug screening and precision medicine.
Other Abstract (Other language abstract of ETD)
ปัจจุบันมีความนิยมในการนำโปรตีนรีคอมบิแนนท์โกรทแฟคเตอร์ (recombinant growth factor) มาใช้เพื่อการเพาะเลี้ยงออร์กานอยด์ (organoid) และลดระยะเวลาการเพาะเลี้ยงเซลล์ในห้องปฏิบัติการมากขึ้น โดยโปรตีนดังกล่าวนี้ถูกผลิตขึ้นด้วยกระบวนการของเซลล์โปรคาริโอตซึ่งไม่มีการดัดแปลงโมเลกุลของโปรตีนหลังการถอดรหัส (post-translational modification) จากข้อจำกัดดังกล่าวและต้นทุนในการผลิตที่มีราคาสูง ทำให้กระบวนการผลิตทางอณูวิทยาโดยพืช (plant molecular farming) จึงเป็นทางเลือกใหม่ที่จะสามารถนำมาปรับใช้ในการแก้ไขปัญหาข้างต้นได้ พบว่าโปรตีนเอพิเดอร์มอลโกรทแฟคเตอร์ที่เป็นโปรตีนในกระบวนการส่งสัญญาณระดับเซลล์นั้นมีความสำคัญต่อการพัฒนาโครงสร้างของเนื้อเยื่อเอพิธีเลียมและการสร้างออร์กานอยด์โดยเฉพาะอย่างยิ่งออร์กานอยด์ของต่อมมีท่อ ในการศึกษาครั้งนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาแพลทฟอร์มสำหรับขนส่งโปรตีนเอพิเดอร์มอลโกรทแฟคเตอร์ โดยการห่อหุ้มโปรตีนเอพิเดอร์มอลโกรทแฟคเตอร์ที่ผลิตจากพืชยาสูบ (Nicotiana benthamiana) ไว้ในไฮโดรเจลของกรดยาลูโรนิก (hyaluronic acid) และแอลจิเนต (alginate) เพื่อนำแพลทฟอร์มที่ได้มาใช้ในกระบวนการสร้างออร์กานอยด์ของต่อมมีท่อที่สภาวะเพาะเลี้ยงแบบระยะสั้น ในขั้นตอนการเพาะเลี้ยงเซลล์เอพิธีเลียมปฐมภูมิที่แยกจากต่อมซับแมนดิบูลาร์ของสุกรและผ่านการจำแนกลักษณะของเซลล์เป็นที่เรียบร้อยแล้วนั้น จะกำหนดช่วงจำนวนเซลล์แพสเสจ (passage number) ไว้ระหว่าง 1-7 และทำทดสอบเซลล์ดังกล่าวด้วยโปรตีนเอพิเดอร์มอลโกรทแฟคเตอร์ที่สกัดได้จากแบคทีเรียและต้นยาสูบเปรียบเทียบกัน ในช่วงความเข้มข้นระหว่าง 5-20 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร ก่อนทำการตรวจวัดอัตราการเพิ่มจำนวนของเซลล์ด้วยวิธี MTT และวิธี luciferase-based ATP จากนั้นผสมกรดไฮยาลูโรนิกและแอลจิเนตที่ปริมาตรต่างๆ เพื่อหาอัตราส่วนที่เหมาะสมต่อการสลายตัวและความสม่ำเสมอของการปล่อยโปรตีนเอพิเดอร์มอลโกรทแฟคเตอร์จากพืชและโปรตีนทดสอบชนิดอื่นๆ โดยทำการวัดอัตราการมีชีวิตรอดของเซลล์ การทำงานของ ATP ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ อิมมูโนฮิสโตเคมิสทรี และทดสอบหน้าที่การทำงานของเซลล์เอพิธีเลียมภายในออร์กานอยด์ที่สร้างขึ้นจากไฮโดรเจลของกรดยาลูโรนิกและแอลจิเนตที่ห่อหุ้มโปรตีนเอพิเดอร์มอลโกรทแฟคเตอร์ดังกล่าว จากการศึกษาพบว่าโปรตีนเอพิเดอร์มอลโกรทแฟคเตอร์ที่สกัดได้จากแบคทีเรียและพืชยาสูบที่ความเข้มข้น 5-20 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตรนั้นสามารถส่งเสริมการเจริญของเซลล์เอพิธีเลียมเพาะเลี้ยงที่ระยะเวลา 6 วันได้อย่างไม่แตกต่างกัน พบว่าที่อัตราส่วน 5:4:1 ของ กรดยาลูโรนิก/แอลจิเนต/โปรตีนเอพิเดอร์มอลโกรทแฟคเตอร์ นั้น เป็นอัตราส่วนเหมาะสมต่อความเสถียรของการนำส่งโปรตีนเอพิเดอร์มอลโกรทแฟคเตอร์จากพืชในการเพาะเลี้ยงระยะสั้น โดยปล่อยโปรตีนที่ร้อยละ 85.8 ภายในเวลา 3 วัน นอกจากนี้การห่อหุ้มโปรตีนเอพิเดอร์มอลโกรทแฟคเตอร์จากพืชด้วยไฮโดรเจลดังกล่าวสามารถเพิ่มความสำเร็จของกระบวนการเกิดออร์กานอยด์และเพิ่มอัตราการมีชีวิตรอดของเซลล์ได้ดีกว่าการเติมลงในอาหารเพาะเลี้ยงเซลล์ ยังพบว่าออร์กานอยด์ที่ถูกสร้างขึ้นจากแพลทฟอร์มของไฮโดรเจลดังกล่าวนี้มีการแสดงออกของโปรตีนที่บ่งชี้ถึงเซลล์เอพิธีเลียมของต่อมมีท่อชนิดต่างๆ เช่น เซลล์อะซินาร์ (AQP5, AQP1, NKCC1, Mist1) เซลล์ท่อ (K18, Krt19) เซลล์โปรเจนิเตอร์ (K14, K15) และเซลล์ไมโอเอพิธีเลียม (α-SMA) และยังพบการแสดงออกของปริมาณอะซินาร์ที่เพิ่มขึ้นภายในออร์กานอยด์ในระดับทรานสคริปโตม (transcriptome) ทั้งนี้ออร์กานอยด์ดังกล่าวยังมีการตอบสนองต่อการกระตุ้นด้วยสารกระตุ้นประสาทโคลิเนอร์จิก (cholinergic) โดยแสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นของระดับแคลเซียมภายในและการหลั่งของเอนไซม์อะไมเลส (α-amylase) ดังนั้นการใช้พืชยาสูบเพื่อกระบวนการผลิตทางอณูวิทยาโดยพืชนั้น จะสามารถผลิตโปรตีนเอพิเดอร์มอลโกรทแฟคเตอร์ที่นำมาใช้ในแพลทฟอร์มไฮโดรเจลสำหรับการสร้างและเพาะเลี้ยงออร์กานอยด์ของต่อมมีท่อที่สภาวะเพาะเลี้ยงแบบระยะสั้นได้ ทั้งนี้แพลตฟอร์มที่ผลิตขึ้นด้วยเทคโนโลยีชีวภาพชนิดนี้จะมีบทบาทสำคัญอย่างมากต่อการสร้างออร์กานอยด์จากเซลล์ผู้ป่วย เพื่อการจำลองต่อมมีท่อสำหรับใช้ในการทดสอบยาและใช้เพื่อการแพทย์แบบแม่นยำในอนาคต
Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-No Derivative Works 4.0 International License.
Recommended Citation
Van, Toan Phan, "Human epidermal growth factor release from hyaluronic acid-based platforms towards in vitro expansion of salivary gland cells" (2022). Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD). 12052.
https://digital.car.chula.ac.th/chulaetd/12052