Chulalongkorn University Theses and Dissertations (Chula ETD)

Other Title (Parallel Title in Other Language of ETD)

การศึกษาภูมิคุ้มกันและการก่อเกิดภูมิแพ้ของอนุภาคเสมือนไวรัสที่นำเสนอสารก่อภูมิแพ้หลักของสารก่อภูมิแพ้กุ้ง

Year (A.D.)

2023

Document Type

Thesis

First Advisor

Alain Jacquet

Faculty/College

Faculty of Medicine (คณะแพทยศาสตร์)

Department (if any)

Department of Biochemistry (fac. Medicine) (ภาควิชาชีวเคมี (คณะแพทยศาสตร์))

Degree Name

Master of Science

Degree Level

Master's Degree

Degree Discipline

Medical Biochemistry

DOI

10.58837/CHULA.THE.2023.670

Abstract

Frequencies of shrimp-induced anaphylaxis are particularly important in Asia; Asian countries consume more than 60% of the global seafood production. Currently, approved allergen-specific immunotherapy (AIT) for shrimp allergy is lacking. Shrimp sensitizations are only managed by strict avoidance and treatment with adrenaline. Clinical studies showed that oral immunotherapy (OIT), oral administrations of increasing amounts of food allergen extracts, can be now recognized as an alternative active treatment to strict food avoidance in certain patients with IgE-mediated food allergy. Up to now, the only FDA-approved OIT is for desensitization of peanut-allergic patients. Recently, sustained unresponsiveness to peanuts by OIT was shown to be associated with the blocking capacity of induced peanut allergen-specific IgG/IgG4. Consequently, any new treatment for food allergy inducing the development of potent blocking IgG responses could be effective. It is well known that Virus-like particles (VLPs) are highly immunogenic through their capacity to promote strong B cell response. VLPs displaying single allergens were shown to be not only hypoallergenic but also able to elicit blocking IgG antibody response. The present study aimed to develop a new VLP-based treatment of shrimp allergy. We designed an AP205 VLP decorated with Pen m 1, the major tropomyosin allergen from the black tiger shrimp (Penaeus monodon), and used the SpyTag/SpyCatcher conjugation system. VLP-Pen m 1 was successfully decorated with 90 copies of dimeric Pen m 1. Dynamic light scattering (DLS) measurement confirmed the monodispersity of purified VLP-Pen m1 particles, with a hydrodynamic radius of 53 nm. Indirect and competitive ELISA IgE assays, using sera from shrimp-allergic patients, showed that VLP-Pen m 1 overall shares the IgE reactivity to natural Pen m 1 or SpyTag-Pen m 1-His6. Functional RBL-SX38 assays revealed that VLP-Pen m 1 exhibited a 41- to 100-fold reduced capacity to degranulate basophils compared to equimolar amounts of SpyTag-Pen m 1-His6. Immunogenicity studies in BALB/C mice evidenced that unadjuvanted VLP-Pen m 1 triggered much higher specific IgG1 and IgG2a levels than equimolar amounts of SpyTag-Pen m 1-His6 mixed with untagged-AP205 VLPs. No specific IgE could be detected under our experimental conditions. In lymphoproliferative assays, restimulated splenocytes from VLP-Pen m 1- or SpyTag-Pen m 1-His6/untagged-AP205 VLP-immunized mice secreted high levels of IFN-γ whereas IL-5 was poorly measured. This cytokine pattern confirmed that VLP-Pen m 1 induced a TH1-biased immune response at least mediated by bacterial RNA packaged in the particles that serve as TLR7/8 ligands. Avidity assay showed that VLP-Pen m 1 elicited specific IgG with higher avidity than soluble SpyTag-Pen m 1-His6. Moreover, time-dependent affinity maturation of Pen m 1-specific IgG antibodies was observed (avidity four weeks post-immunization #3 > avidity two weeks post-immunization #3). Finally, purified Pen m 1-specific IgG antibodies from VLP-Pen m 1-immunized mice inhibited the IgE binding to Pen m 1 in a dose-dependent manner reaching 70% of inhibition at an IgG/allergen molar ratio of 250. In conclusion, our data show that the unidirectional display of Pen m 1 on VLP surfaces drastically reduced its allergenicity and optimized the induction of allergen-specific IgG-blocking antibodies. AIT based on VLP-Pen m 1 could represent a new approach for the desensitization of shrimp-allergic patients.

Other Abstract (Other language abstract of ETD)

ภูมิแพ้กุ้งพบได้บ่อยและมีบทบาทสำคัญมากอย่างยิ่งในทวีปเอเชีย โดยประเทศในทวีปเอเชียนี้มีการบริโภคอาหารทะเลมากกว่าร้อยละ 60 ของการผลิตอาหารทะเลจากทั่วโลก ซึ่งในปัจจุบันนี้ยังขาดการรักษาด้วยภูมิคุ้มกันบำบัดสำหรับการแพ้กุ้ง มีเพียงการจัดการโดยหลีกเลี่ยงการสัมผัสต่อสารก่อภูมิแพ้ และการได้รับอะดรีนาลีนอย่างเคร่งครัดเท่านั้น การศึกษาทางคลินิกแสดงให้เห็นว่าภูมิคุ้มกันบำบัดแบบในช่องปาก (OIT) สามารถถูกรับรู้ได้ว่าเป็นการรักษาภูมิคุ้มกันบำบัดแบบทางเลือกแทนการหลีกเลี่ยงอาหารอย่างเข้มงวดในผู้ป่วยบางรายที่มีอาการแพ้อาหารอย่างรุนแรง ที่ผู้ป่วยจะมีแอนติบอดี้ชนิด E (IgE) เป็นสื่อกลางในการแสดงการเกิดภูมิแพ้ได้ อย่างไรก็ตาม OIT สำหรับการรักษาอาการแพ้เพียงอย่างเดียวที่ได้รับการยอมรับจากองค์การอาหารและยา (FDA) คือ การลดอาการแพ้ในผู้ป่วยที่แพ้ถั่วลิสง โดยการไม่ตอบสนองต่อถั่วลิสงอย่างต่อเนื่องโดย OIT จะแสดงให้เห็นถึงความสัมพันธ์เกี่ยวกับการเหนี่ยวนำการเกิดของระดับแอนติบอดี้ชนิด G และซับคลาส 4 (IgG/IgG4) ที่ซึ่งมีความสามารถในการยับยั้งปฏิกิริยาก่อเกิดการแพ้จาก IgE ดังนั้นอนุภาคเสมือนไวรัส (VLP) ที่มีการแสดงสารก่อภูมิแพ้ถูกแสดงให้เห็นว่าเป็น VLP ที่ไม่ก่อให้เกิดอาการแพ้และอีกทั้งยังกระตุ้นการตอบสนองของแอนติบอดี้ IgG เพื่อใช้ในการยับยั้งการเกิดอาการแพ้ วัตถุประสงค์การศึกษานี้คือ เพื่อพัฒนาการรักษาภูมิแพ้กุ้งโดยการใช้การรักษาใหม่ที่อยู่บนพื้นฐานของ VLP ดังนั้นในการวิจัยในครั้งนี้จึงออกแบบ VLP ชนิด AP205 ที่มีโปรตีนรีคอมบิแน้นท์สารก่อภูมิแพ้หลักในกุ้งลายเสือ (Penaeus monodon) ได้แก่ โทรโพไมโอซิน หรือ Pen m 1 ประดับอยู่บนพื้นผิวของ VLP หรือสามารถเรียกว่า VLP-Pen m 1 โดยใช้เทคโนโลยี SpyTag/SpyCatcher ในการตกแต่งสารก่อภูมิแพ้กุ้งบนพื้นผิวของ VLP ได้ถึง 90 ชุดของสารก่อภูมิแพ้กุ้ง และได้มีการวัดขนาดของ VLP-Pen m 1 โดยใช้การกระเจิงของแสงแบบไดนามิก (DLS) ให้ผลปรากฏว่า VLP-Pen m 1 มีลักษณะ monodispersity ที่มีขนาด 53 นาโนเมตร ซึ่งการทดสอบ Indirect และ Competitive IgE ELISA assays ซึ่งใช้ตัวอย่างซีรั่มจากผู้ป่วยที่แพ้กุ้ง แสดงให้เห็นว่า VLP-Pen m 1 มีการแบ่งปันปฏิกิริยาของ IgE กับ Pen m 1 ในธรรมชาติหรือโปรตีนรีคอมบิแน้นท์ของ Pen m 1 (SpyTag-Pen m 1-His6) นอกจากนั้นการทดสอบ RBL-SX38 ยังแสดงให้เห็นว่า VLP-Pen m 1 มีความสามารถในการยับยั้งการหลั่งสารที่มีความสำคัญในกระบวนการเกิดการอักเสบจากเม็ดเลือดขาวชนิดเบโซฟิลตั้งแต่ 41 ถึง 100 เท่าเมื่อเทียบกับ SpyTag-Pen m 1-His6 ในปริมาณที่เท่ากัน ทั้งนี้ยังมีการศึกษาการสร้างภูมิคุ้มกันในหนูสายพันธุ์ BALB/C แสดงให้เห็นว่า VLP-Pen m 1 ที่ปราศจากสารกระตุ้นภูมิคุ้มกัน (adjuvant) มีความสามารถในการกระตุ้นระดับแอนติบอดี้ IgG ซับคลาส 1 (IgG1) และ ซับคลาส 2a (IgG2a) ที่เฉพาะเจาะจงสูงกว่าเมื่อเทียบกับกลุ่มของ SpyTag-Pen m 1-His6 ผสมกับ VLP ชนิด AP205 ที่ไม่มีการติดแท็กของ SpyCatcher (untagged-AP205 VLP) ในปริมาณที่เท่ากัน ในส่วนของการเกิดการแพ้ แอนติบอดี้ IgE ที่เฉพาะเจาะจงไม่สามารถตรวจพบได้ภายใต้การทดลองนี้ หลังจากนั้นได้มีการทดสอบ lymphoproliferative assays ซึ่งแสดงให้เห็นว่าม้ามของหนูในกลุ่มที่ได้รับการฉีด VLP-Pen m 1 หรือกลุ่มที่ได้รับ SpyTag-Pen m 1-His6/untagged-AP205 VLP เมื่อถูกนำมากระตุ้นใหม่ด้วย SpyTag-Pen m 1-His6 ผลปรากฏว่ามีการหลั่งไซโตไคน์ชนิดอินเตอร์เฟอรอนแกมมา (IFN-γ) สูง ในขณะที่การหลั่งอินเตอร์ลิวคิน-5 (IL-5) น้อยมากหรือแทบจะไม่สามารถวัดได้ ซึ่งรูปแบบการตรวจวัดปริมาณไซโตไคน์นี้ช่วยในการยืนยันว่า VLP-Pen m 1 มีการกระตุ้นภูมิคุ้มกันการตอบสนองแบบ TH1-biased immune response ซึ่งอย่างน้อยก็เกี่ยวกับอาร์เอ็นเอ (RNA) ของแบคทีเรียที่ถูกบรรจุอยู่ในอนุภาคที่ทำหน้าที่เป็นลิแกนด์ TLR7/8 การทดสอบ avidity assay แสดงให้เห็นว่า VLP-Pen m 1 กระตุ้นแอนติบอดี้ IgG เฉพาะเจาะจงมีความสามารถในการจับระหว่างแอนติบอดี้ IgG กับสารก่อภูมิแพ้กุ้ง (avidity) สูงกว่า SpyTag-Pen m 1-His6 นอกจากนี้ยังพบการเพิ่มปริมาณของแอนติบอดี้ IgG ที่มีความจำเพาะต่อ Pen m 1 ซึ่งมีความสัมพันธ์กับเวลา โดยมีรายละเอียดดังนี้ ความสามารถ avidity ที่ 4 สัปดาห์หลังการฉีดกระตุ้นภูมิคุ้มกัน (#3) > avidity ที่ 2 สัปดาห์หลังการฉีดกระตุ้นภูมิคุ้มกัน (#3) สุดท้ายนี้จึงทำการทดสอบแอนติบอดี้ IgG ที่จำเพาะต่อ Pen m 1 ซึ่งที่ได้จากหนูที่ได้รับการฉีดกระตุ้นภูมิคุ้มกันโดย VLP-Pen m 1 มีความสามารถในการยับยั้งโดยการจับกับ Pen m 1 แทนที่แอนติบอดี้ IgE ที่ก่อเกิดอาการแพ้ ในลักษณะที่เกิดขึ้นกับปริมาณโดส พบว่าสามารถยับยั้งได้สูงถึงร้อยละ 70 ของการยับยั้งที่อัตราส่วนของแอนติบอดี้ IgG/สารก่อภูมิแพ้ที่ 250 จึงสรุปได้ว่าการแสดงรูปแบบทิศทางเดียวของ Pen m 1 ที่ถูกตกแต่งบนพื้นผิวของ VLP (VLP-Pen m 1) ช่วยลดการก่อภูมิแพ้ได้อย่างมากและอีกทั้งยังเพิ่มประสิทธิภาพในการเหนี่ยวนำการเกิดแอนติบอดี้ชนิด IgG ที่จำเพาะต่อสารก่อภูมิแพ้ที่ใช้ในการยับยั้งการเกิดปฏิกิริยาการแพ้ได้ ดังนั้นการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันบำบัดโดยใช้ VLP-Pen m 1 อาจเป็นแนวทางใหม่สำหรับการลดความไวต่อสารก่อภูมิแพ้ในผู้ป่วยที่แพ้กุ้ง

Download

Share

COinS
 
 

To view the content in your browser, please download Adobe Reader or, alternately,
you may Download the file to your hard drive.

NOTE: The latest versions of Adobe Reader do not support viewing PDF files within Firefox on Mac OS and if you are using a modern (Intel) Mac, there is no official plugin for viewing PDF files within the browser window.